酵母展示脂肪酶是一种高效的催化剂,其制备方法涉及基因工程技术和微生物培养工艺.首先,通过人工合成的方法,合成米根霉的脂肪酶基因(Genbank号:AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164).将这两个基因连接到带有连接肽序列的核苷酸序列中,并在两端添加EcoRI和NotI酶切位点.
接下来,利用PCR扩增技术,将上述序列插入到pPIC9K质粒中,形成重组质粒.通过线性化处理,将重组质粒导入毕赤酵母GS115感受态细胞中,经过电转,筛选和发酵培养,最终获得多拷贝阳性重组菌株.将菌体诱导培养后,通过生物印迹和冷冻干燥处理,制得酵母展示脂肪酶.
生物印迹过程中,油酸作为配体可以诱导酶结构改变,从而提高催化转化率.酵母展示脂肪酶不仅具有较高的操作稳定性和耐热性,还能在酯化反应中实现单一产物的高转化率,转化率可达85%以上.
在合成L-抗坏血酸亚油酸酯的过程中,首先将L-抗坏血酸和亚油酸溶于有机溶剂四氢呋喃中.然后加入酵母展示脂肪酶,在无氧条件下于50~60℃反应4~8小时.反应过程中,搅拌速率控制在200~250转/分钟,以促进反应充分进行.
为提高酯化反应效率,可以在反应结束前加入分子筛,继续搅拌10~12小时,锁住水分,促进酯化反应进一步进行.反应结束后,通过离心,旋转蒸发,水洗和重结晶等步骤,最终得到高纯度的L-抗坏血酸亚油酸酯产品.
与传统化学法相比,生物酶法不仅反应条件温和,产物单一,而且转化率和产率显著提高.实验表明,生物酶法合成L-抗坏血酸亚油酸酯的产率和转化效率分别可达83%和85%,而化学法仅为33%和44%.