目前,实现维生素C与EPA酯化的方法主要有化学法和生物酶法.化学法存在转化条件苛刻,无特异性,产物复杂,副产物多,分离难,安全性差等弊端,因此,生物酶法越来越受到青睐.脂肪酶是目前维生素酯合成中使用最广泛的酶,但其生产成本高,固定化过程繁杂费时,大大局限了其商业化应用.酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸EPA酯的方法,可显著降低生产成本,同时达到较高的酯化反应效率和产率.
该方法的具体步骤包括:将L-抗坏血酸和EPA溶于有机溶剂中,加入酵母展示脂肪酶,无氧条件下于50~60℃反应4~8小时,分离,纯化制得L-抗坏血酸EPA酯.优选的有机溶剂为正己烷和四氢呋喃的混合物,体积比优选为1∶1.每升有机溶剂中L-抗坏血酸,EPA和酵母展示脂肪酶的加入量分别为15~35g,150~350g,50~100g.搅拌速率为200~250转/分钟.在分离纯化前加入分子筛,继续搅拌反应10~12h,锁住水分,促进酯化反应进一步进行.
酵母展示脂肪酶通过如下方法制备:将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(PIchIapastorIs)GS115,将所得转化子接种于BMMY培养基中,诱导培养72~144小时后离心收集菌体,菌体经冲洗,生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶.所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成.脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列,毕赤酵母GS115为商业化产品,可从InvItrogen公司购得.它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164.载体pPIC9K为商业化产品(如InvItrogen公司),它存在MFα1信号肽序列(Genbank号:M17301),同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号:Z46233).重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组,提高表达稳定性.优选的,所述生物印迹所用配体为油酸,它可以诱导酶结构改变,提高转化率.