目前实现维生素C和DHA酯化的方法主要包括化学法和生物酶法.化学法存在转化条件苛刻(强酸,碱催化,高温高压),无特异性,产物复杂,副产物多,分离难,安全性差等弊端,而生物酶法,尤其是脂肪酶催化法,因其高效,专一性和环境友好等优点逐渐成为研究热点.
然而,传统脂肪酶催化法在商业应用中面临生产成本高,固定化过程繁杂费时等问题.为此,酵母展示脂肪酶催化合成技术应运而生.该技术通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞(PIchIapastorIsGS115),诱导培养后,脂肪酶表达并分泌到胞外,同时利用细胞壁α凝集素将脂肪酶固定在细胞表面.这种方法不仅提高了操作稳定性,耐热性和重复性,还能获得单一的酯化产物(L-抗坏血酸DHA酯),且转化率和产率显著提高.
酵母展示脂肪酶的制备过程包括以下几个关键步骤:
1.合成米根霉(RhIzopusoryzae)的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因,并在脂肪酶基因C端加上连接肽序列.
2.将上述基因序列克隆到载体pPIC9K中,形成重组质粒.
3.通过电转法将重组质粒导入毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性转化子并进行诱导培养.
4.收集菌体,经生物印迹处理和冷冻干燥后获得酵母展示脂肪酶.