研究中采用的NAD(P)H依赖型还原酶选自多个微生物来源:
-酿酒酵母(GenBankNP_013953.1)
-胶红酵母(BAH28833.1)
-甲醇毕赤酵母(AAW06921.1)
-激烈火球菌(NP_579689.1)
合成路线以4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮为底物,通过酶催化还原羰基得到手性醇.采用双酶共表达系统实现辅因子原位再生,其中葡萄糖脱氢酶(GDH)催化效率可达45U/mL.
最优反应条件为:
-pH7.0-8.0(磷酸钾缓冲体系)
-温度25-30℃
-底物浓度10%w/v
-NADP+浓度7.6mM
在30L发酵罐规模下,采用重组大肠杆菌全细胞催化剂可实现72%的产物收率,ee值>99.7%.后处理采用乙酸乙酯萃取结合减压蒸馏,最终产物经1HNMR(400MHz,DMSO-d6)和手性HPLC验证结构.