卤醇脱卤酶突变体在手性环氧氯丙烷合成中的应用

背景介绍

卤醇脱卤酶(HHDH,EC.4.5.1.X)是一种在生物催化领域中非常重要的酶,能够催化邻卤醇脱卤生成相应的环氧化物,且不需要任何辅助因子参与.此外,在带负电荷的亲核试剂(如卤化物,叠氮化物,氰化物或亚硝酸盐)存在下,能够催化环氧化物开环,并形成新的C-N,C-C,C-O或C-S键,生成相应的β-取代醇.由于具有严格的立体选择性,卤醇脱卤酶在合成手性环氧化物和手性醇中展现出巨大的潜力.

手性环氧氯丙烷(ECH)是一种重要的三碳手性化合物,用于制备他汀类降血脂药物,芳氧丙胺醇类β-肾上腺素阻断剂等多种药物,在医药,农药和精细化工等领域应用广泛,市场需求不断攀升.目前,工业上采用的外消旋环氧氯丙烷动力学水解开环工艺存在理论产率仅为50%以及Salen催化剂回用困难等缺陷.因此,开发绿色,高效的手性环氧氯丙烷合成技术具有重要意义.

卤醇脱卤酶突变体的研发

近年来,随着基因测序,基因合成等技术的发展,新的卤醇脱卤酶不断被挖掘,表征和改造.然而,野生型卤醇脱卤酶对1,3-二氯丙醇等人工底物并不具有严格的立体选择性,无法获得高光学纯度的产物,限制了卤醇脱卤酶的工业应用.为了解决这一问题,可研发了一种具有高度立体选择性的卤醇脱卤酶突变体.

该突变体来源于丙酸杆菌(PropIonIcIcellasuperfundIa),通过对氨基酸序列的第87位,88位进行单位点突变或多位点突变,显著提高了酶的催化活力和立体选择性.例如,突变体Ps_N87K催化合成(R)-环氧氯丙烷的活力为野生型的2.2倍,而催化合成(S)-环氧氯丙烷的活力为野生型的18.5%,产物(R)-环氧氯丙烷的ee值由22.8%提高至92.4%.双突变体Ps_N87K/R88F催化合成(R)-环氧氯丙烷的活力为野生型的1.99倍,产物(R)-环氧氯丙烷的ee值提高至98.1%.

合成路线与工艺优化

可采用了一种高效的重组基因工程技术来构建和表达卤醇脱卤酶突变体.通过将突变的基因序列克隆到pET-28a载体上,并将其转化至大肠杆菌E.colIBL21(DE3)宿主细胞中,经过诱导表达后获得卤醇脱卤酶突变体表达菌株.在催化1,3-二氯丙醇合成(R)-环氧氯丙烷的过程中,可优化了反应条件,包括底物浓度,催化剂用量,反应介质pH值和温度等.

具体工艺流程包括:将含有卤醇脱卤酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养离心获得的湿菌体作为催化剂,以1,3-二氯丙醇为底物,以pH为7~12的缓冲液为反应介质,在20~55℃,400~800rpm条件下反应.反应结束后,将反应液分离纯化,获得高纯度的(R)-环氧氯丙烷.