在当代医药工业中,约40%的化学药物分子含有手性胺结构单元,其光学纯度直接影响药物疗效与安全性.(1S,3AR,6AS)-八氢环戊二烯并[C]吡咯-1-羧酸作为丙型肝炎特效药特拉瑞韦的核心中间体,其分子结构包含三个立体中心,传统化学合成面临收率低(理论最高50%),重金属催化剂成本高等瓶颈.目前主流生产工艺依赖于手性拆分技术,但该手性胺中间体生产工艺存在固有缺陷,亟需开发新型生物催化体系.
通过土壤微生物筛选获得的白曲霉AspergIllusalbIcans14,其基因组中发现的单胺氧化酶AaMAO7-6展现出独特催化特性.采用CTAB法提取基因组DNA后,通过基因狩猎技术克隆得到1561bp的基因序列(含34bp内含子),经重叠PCR优化后获得1527bp的功能基因.该酶与已知MAO-N-D5相似度仅33.2%,但其对顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷的转化效率显著优于传统黑曲霉来源酶.
在重组表达体系中,将AaMAO7-6基因插入pET28a载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后获得重组菌株工厂.优化后的培养条件为:0.5mMIPTG诱导,30℃表达20-36小时,最终湿菌体收率达50-150g/L.酶纯化采用镍柱亲和层析,BufferA(50mM磷酸盐,pH8.0)洗涤后,用含250mM咪唑的缓冲液洗脱,最终获得电泳级纯度的目标蛋白.
创新性地将生物催化与化学转化耦合,建立三步连续反应体系:
1.酶促氧化-磺化偶联反应:50g/L湿菌体催化20g/L底物,通氧条件下加入1.2当量NaHSO3,37℃反应24小时,产物收率达80%
2.氰化反应:环戊基甲醚溶剂中,1.2当量NaCN于10℃反应1小时,转化生成腈类中间体
3.酸性水解:33%盐酸回流过夜后经离子交换树脂纯化,最终获得ee值95%的目标产物