羰基还原酶突变体及其在不对称合成手性化合物中的应用

羰基还原酶的背景

羰基还原酶(CarbonylReductase,EC1.1.1.184)属于氧化还原酶大类,广泛存在于自然界中的植物,微生物和哺乳动物组织中.它依赖NADP(H)或NAD(H)作为辅酶,催化脂肪酮,芳香酮,醛和醌等不对称还原生成相应的手性醇.手性醇在医药制造,食品健康和农用化学品等领域具有重要的应用价值.

羰基还原酶的分类

根据氨基酸序列长度和催化活性位点的差别,羰基还原酶主要分为三个超家族:醛酮还原酶超家族(Aldo-KetoReductases,AKRs),中链脱氢酶/还原酶超家族(MedIum-ChaInDehydrogenases/Reductases,MDRs)和短链脱氢酶/还原酶超家族(Short-ChaInDehydrogenases/Reductases,SDRs).其中,SDRs是已知的最大,最古老的蛋白质超家族之一,广泛分布于各种生物体中.

羰基还原酶KmCR的改造策略

针对羰基还原酶KmCR催化活性不高,立体选择性不强的缺点,研究人员采用了一种区域易错PCR(epPCR)的定向进化策略.通过计算机辅助分析,选择合适的区域进行突变,进而筛选出具有更高活力和立体选择性的突变体.具体步骤包括:

通过同源建模和分子对接分析,确定底物与酶活性位点的相互作用区域.

设计引物,进行区域epPCR,缩小突变文库的规模.

建立薄层色谱和高通量液相色谱的筛选方法,筛选出最优突变体.