腈水解酶突变体在普瑞巴林手性中间体合成中的应用

腈水解酶突变体的开发背景

普瑞巴林,化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸,作为一种重要的药物分子,是抑制性神经递质γ-氨基丁酸的3位异丁基取代物.普瑞巴林在治疗神经疼痛,焦虑以及癫痫等重大疾病中发挥着重要作用.与同类药物相比,普瑞巴林具有服用剂量低,次数少,持续时间长,副作用小和耐受性强等优点.然而,由于普瑞巴林R型异构体的活性仅为S型的1/10,因此开发高光学纯度S型普瑞巴林的合成技术在制药工业中显得尤为重要.

(S)-3-氰基-5-甲基己酸是普瑞巴林的关键手性中间体,该化合物通过一步加氢即可合成S型普瑞巴林.传统的合成方法存在原料昂贵,工艺复杂,原子经济性差等问题,而利用腈水解酶水解外消旋异丁基丁二腈合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的路线,因原料廉价,工艺简单,原子经济性高等优势而受到关注.然而,已报道的腈水解酶催化活力和立体选择性低,不能满足工业化生产的需求.

腈水解酶突变体的构建及其优势

为了克服传统腈水解酶在工业生产中的不足,本研究基于实验室前期构建的芜菁/高山南芥腈水解酶嵌合体的突变体BaNIT/L223Q/H263D/Q279E(简称BaNITmut),对其氨基酸序列进行了定点饱和突变,开发了一系列性能更优的腈水解酶突变体.具体突变位点包括第127位的M突变为I,第260位的Q突变为T或H,形成了BaNITmut/M127I,BaNITmut/M127I/Q260T和BaNITmut/M127I/Q260H三种突变体.

与亲本腈水解酶相比,上述突变体在催化活力和副产物生成方面表现出显著优势.例如,突变体BaNITmut/M127I的催化活力提高了1.8倍,副产物酰胺含量从18.9%降至6.2%;双突变体BaNITmut/M127I/Q260T的催化活力提高了2.3倍;而突变体BaNITmut/M127I/Q260H在55℃下的温度稳定性提高了3.3倍,这些突变体均保持了高对映体选择率(E值超过300).

突变体的制备与表征

通过设计特定的引物并利用重叠延伸PCR的方法对原始质粒pET28bmut进行全质粒扩增,成功构建了表达腈水解酶突变体的重组大肠杆菌E.colIBL21(DE3).具体步骤包括:以含有目的基因片段的重组质粒pET28bmut为模板,设计并合成特定的引物,进行PCR扩增后,通过DpnI内切酶酶切去除模板质粒,将PCR产物转化至E.colIBL21(DE3)感受态细胞中,筛选阳性克隆子后进行测序验证,最终获得了表达腈水解酶突变体的重组大肠杆菌.

这些突变体大肠杆菌菌株在发酵培养后,通过离心收集菌体,制备成静息细胞,用于催化外消旋异丁基丁二腈水解反应.实验结果显示,突变体BaNITmut/M127I/Q260T在催化反应中的转化率和产物光学纯度显著提高,能够在24小时内达到48%以上的转化率,并且产物的对映体过量值(eep)超过99%,对映体选择率E值始终保持在300以上,具有突出的工业应用前景.