酮酸还原酶是一类关键的氧化还原酶,能够催化前手性酮酸不对称还原为相应的羟基酸.这类酶在生物催化领域中具有重要意义,尤其是在手性化合物的生产中.手性2-羟酸是一类在羧基侧C1位有羟基取代的化合物,广泛应用于医药和精细化工领域.例如,(R)-扁桃酸是生产半合成青霉素,头孢菌素等药物的重要中间体,(R)-邻氯扁桃酸则是合成抗血栓药氯吡格雷的关键手性砌块.
传统的手性2-羟酸制备方法主要依赖于化学动力学拆分,但该方法存在收率低,光学纯度不高,反应条件苛刻等缺陷.相比之下,生物催化法因其高立体选择性,温和的反应条件和环境友好性而备受关注.其中,氧化还原级联去消旋法通过多酶共表达技术,能够高效地将外消旋2-羟酸转化为单一构型产物,具有显著的工业化应用潜力.
本文研究了一种来源于乳酸明串珠菌(LeuconostoclactIs)的酮酸还原酶LlKAR.通过基因工程手段,将该酶的编码基因克隆并导入宿主菌EscherIchIacolI中,构建了重组基因工程菌.实验表明,LlKAR能够高效催化多种芳香族2-酮酸,并表现出较高的底物装载量和催化效率.与已知的酮酸还原酶相比,LlKAR在400mM底物浓度下仍能实现完全转化,展现了其在实际生产中的应用潜力.
为了实现更高效的去消旋化反应,研究人员构建了单菌双质粒三酶串联氧化还原级联体系.该体系包含酮酸还原酶(LlKAR),2-羟酸脱氢酶(HADH)和葡萄糖脱氢酶(GDH),能够在外消旋芳香2-羟酸的催化过程中实现辅酶的循环再生,避免了外源性辅酶的添加,从而降低了生产成本.
通过三酶共表达体系,研究人员成功实现了多种外消旋芳香2-羟酸的高效去消旋化.例如,在300mM邻氯扁桃酸的去消旋化反应中,LlKAR展现出极高的催化活性,最终产物(R)-邻氯扁桃酸的收率和光学纯度均超过99%,空时得率高达83.8g/(L·d).这一结果证明了该体系在工业化生产中的可行性.
此外,研究人员还对该体系的反应条件进行了优化.实验表明,在30℃,pH7.0条件下,使用8g/L湿菌体催化剂,外消旋邻氯扁桃酸能够被高效转化为光学纯(R)-邻氯扁桃酸.优化后的反应体系不仅提高了催化效率,还降低了能耗和原料成本,为工业化应用奠定了基础.