COS-7细胞源自CV-1细胞株,经转染起始点缺失的SV40病毒突变体得到;编码表达野生型T抗原,所以该细胞适合作为需要SV40T抗原表达的载体的转染宿主.该细胞表达T抗原,允许SV40病毒的溶解性生长,支持40℃时温度敏感性A209病毒的复制,支持起始区域缺陷的SV40突变体的复制.因含有SV40病毒的DNA序列,该细胞需要在2级生物安全柜中操作.
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用于UGT1A1基因野生型和Q239X突变型在cos-7细胞中的表达及功能研究
探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1Al(uridine diphosphate glucuronyltransferase 1A1,UGT1A1)基因野生型和Q239X突变型在非洲绿猴肾细胞(cos-7细胞)中的表达及功能.
方法:构建UGT1A1基因野生型过表达,UGT1A1基因Q239X突变型过表达慢病毒载体和阴性慢病毒载体,分别对体外培养的cos-7细胞进行转染.转染72h后,荧光倒置相差显微镜及流式细胞仪观察和检测cos-7细胞的转染效率,用l.Omg/L嘌呤霉素筛选1周得到稳定转染细胞株,采用DNA测序鉴定所构建的稳定转染UGT1A1基因的cos-7细胞株.将cos-7细胞分为5组:空白对照组,阴性慢病毒组,UGT1A1基因野生型组,UGT1A1基因Q239X杂合突变型组,UGT1A1基因Q239X纯合突变型组.PCR,Real-Time PCR和Western Blot检测各组cos-7细胞中UGT1A1基因的DNA,mRNA和蛋白表达情况;绘制非结合胆红素的标准曲线,设计两组反应,野生型为对照组,Q239X杂合突变型为实验组,催化非结合胆红素与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(Uridine diphosphate glucuronic acid,UDPGA)的结合反应,利用高效液相色谱仪(High performance 1 iquid chromatograph,HPLC)定量检测非结合胆红素浓度变化,分析两组UGT1A1酶对非结合胆红素的催化活性.
结果:1.荧光倒置相差显微镜观察阴性病毒组,UGT1A1基因野生型组,UGT1A1基因Q239X杂合突变组,UGT1A1基因Q239X纯合突变组的cos-7细胞均可见明显的绿色荧光表达并且细胞状态良好,流式细胞仪检测转染效率均>85%,转染效率高,可用于后续实验.
2．DNA测序结果显示稳定过表达UGT1A1基因野生型,Q239X杂合突变型,Q239X纯合突变型cos-7细胞株构建成功.
3．结合突变位点设计引物并进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物,结果显示UGT1A1基因野生型,Q239X杂合突变型,Q239X纯合突变型cos-7细胞在DNA水平均可见UGT1A1基因表达,而空白对照组,阴性慢病毒组无UGT1A1基因表达.
4．Real-Time PCR结果显示UGT1A1基因野生型,Q239X杂合突变型,Q239X纯合突变型cos-7细胞UGT1A1基因的mRNA表达量较空白对照组和阴性慢病毒组均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05).但UGT1A1基因野生型,Q239X杂合突变型,Q239X纯合突变型细胞UGT1A1基因的mRNA表达量无显著差异(P>0.05).
5．Western blot结果显示UGT1A1基因野生型,Q239X杂合突变型cos-7细胞在55kD处可见UGT1A1蛋白表达,蛋白表达量有差异(P<0.05),而空白对照组,阴性慢病毒组,Q239X纯合突变型组无UGT1A1蛋白表达.
6．绘制非结合胆红素的标准曲线,得到方程式:y=68028x+6813.7,R2=0.9923(其中x为非结合胆红素浓度µM,y为非结合胆红素峰面积),非结合胆红素在0.25-2µM浓度范围内与非结合胆红素峰面积线性关系良好.
7．分别用UGT1A1基因野生型,Q239X杂合突变型cos-7细胞模型匀浆催化非结合胆红素与UDPGA的葡萄糖醛酸化反应,UGT1A1野生酶和Q239X杂合突变酶在15min内的催化作用最强,使得结合胆红素的生成量,非结合胆红素浓度下降幅度,且Q239X杂合突变酶催化非结合胆红素浓度下降幅度低于UGT1A1野生酶.
结论:1.UGT1A1基因Q239X突变不影响基因的转录表达.
2. UGT1A1基因Q239X纯合突变使其翻译合成的谷氨酰胺变为终止密码子,基因表达终止,无UGT1A1蛋白生成.
3.UGT1A1基因Q239X杂合突变可表达UGT1A1蛋白,其生成的UGT1A1酶催化非结合胆红素能力低于UGT1A1基因野生型.
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