D407人视网膜色素上皮细胞分离自视网膜组织;视网膜色素上皮(RPE)位于脉络膜和光感受器细胞外节之间,是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子,水,营养物质和代谢终产物转运通道;主要是由单层色素上皮细胞所构成,排列十分规则.人视网膜色素上皮参与视黄醇循环,吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性,并分泌多种生长因子,帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性.细胞呈多角形,细胞分为三部分,即顶部,体部和基底部.
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用于IL-33在β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞中的表达及作用机制研究
以IL-33作为主要研究对象,研究其在β-淀粉样蛋白(Aβ)刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性.2.初步探明IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制.
方法:1.IL-33在β-淀粉样蛋白刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性研究采用MTT法检测不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞后不同时间点的细胞存活率,观察其对视网膜色素上皮细胞损伤的影响.提取不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞24h后细胞RNA,采用定量PCR检测IL-33mRNA水平;收集细胞培养上清,ELISA检测IL-33蛋白表达;加入NF-κB,ERK1/2,JNK,p38MAPK信号通路抑制剂后,采用定量PCR及ELISA检测0.3µMAβ1-40刺激D407细胞24h后IL-33mRNA及蛋白水平表达,鉴定β-淀粉样蛋白刺激视网膜色素上皮细胞后调控产生IL-33的信号通路.
2. IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制研究采用定量PCR检测不同浓度的IL-33刺激D407细胞16h后其受体ST2LmRNA表达情况,流式细胞术检测100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后细胞表面受体ST2L表达;不同浓度的IL-33刺激D407细胞16h后,收集细胞及培养上清,定量PCR和ELISA检测炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-αmRNA和蛋白表达,探讨IL-33因子对D407细胞的作用机制;加入NF-κB,ERK1/2,JNK,p38MAPK信号通路抑制剂后,采用定量PCR及ELISA检测100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后上述炎症因子的表达,鉴定调控产生炎症因子的信号通路.
结果:1.IL-33在β-淀粉样蛋白刺激人视网膜色素上皮细胞中的表达特性研究1.1 10.3µM Aβ1-40刺激组较正常组细胞形态变圆,胞体肿胀,细胞排列数量减少,细胞间间隙增加,且随Aβ1-40刺激浓度增加变化明显,而小于0.3µM Aβ1-40刺激组细胞形态无明显变化.MTT检测结果表明:随着Aβ1-40刺激浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,除了0.001µMAβ1-40刺激组外,其余各刺激组与正常对照组相比细胞存活率均显著降低(P<0.05).随着0.3µM和1µM Aβ1-40刺激D407细胞时间的延长,细胞存活率也逐渐下降,且与对照组相比均有显著性差异(P<0.05).
1.2不同浓度Aβ1-40刺激D407细胞后,IL-33mRNA及蛋白表达水平均增加,且在0.3µM刺激浓度时表达显著增加(P<0.05).结果提示:Aβ1-40刺激D407细胞后能够引起IL-33表达上调.
1.3加入ERK1/2和p38MAPK信号通路抑制剂,0.3µM Aβ1-40刺激D407细胞24h后,IL-33mRNA表达水平显著降低(P<0.05),但只有加入ERK1/2信号通路抑制剂后,细胞培养上清IL-33蛋白水平才有明显下降(P<0.05).结果提示:Aβ1-40刺激D407细胞后,IL-33的产生主要是通过ERK1/2信号通路调控,而p38MAPK信号通路仅参与了IL-33转录水平的调控.
3. IL-33在人视网膜色素上皮细胞中的作用及机制研究
2.1IL-33因子刺激D407细胞后,ST2L mRNA表达显著增加(P<0.05),并随着IL-33刺激浓度的增加而增加,且在100ng/ml IL-33刺激时表达量最高.采用流式细胞术检测D407细胞表面受体表达结果显示:D407细胞表面ST2L表达阳性,且在100ng/ml IL-33因子刺激细胞16h后表达上调.
2.2采用定量PCR及ELISA检测IL-33因子刺激D407细胞后炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-αmRNA及蛋白水平表达.结果显示:20,50,100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后,炎症因子mRNA及蛋白水平表达均显著增加(P<0.05),且随着IL-33因子刺激浓度的增加,炎症因子表达均逐渐增加,并在100ng/mlIL-33刺激时表达量最高.结果提示:IL-33刺激D407细胞后IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α因子表达上调.
2.3加入NF-κB,ERK1/2,JNK,p38MAPK信号通路抑制剂,100ng/ml IL-33刺激D407细胞16h后,定量PCR和ELISA检测炎症因子mRNA及蛋白水平表达,结果显示:加入p38MAPK信号通路抑制剂后,IL-6表达显著下降;加入ERK1/2信号通路抑制剂后,IL-8表达显著下降;加入NF-κB信号通路抑制剂后,IL-1β表达显著下降;而加入JNK信号通路抑制剂后,TNF-α表达显著下降(P<0.05).结果表明:IL-33因子刺激D407细胞后炎症因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α的产生是分别通过p38MAPK,ERK1/2,NF-κB以及JNK信号通路调控.
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