5-甲酰环连接酶抗体是一类可以特异性结合5-甲酰环连接酶的多克隆抗体,主要用于体外检测5-甲酰环连接酶的免疫学实验. 叶酸作为介导一碳代谢的重要辅因子,参与生物体内的多种代谢活动.5-甲酰四氢叶酸环化连接酶(5FCL)被报道催化贮存形式的5-甲酰四氢叶酸(5-CHO-THF)向代谢活性形式的叶酸转化.
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用于结核分枝杆菌叶酸代谢相关基因Rv0992c的性质及功能研究
通过生物信息学方法对M.tuberculosis H37Rv的未知功能基因Rv0992c的蛋白产物进行结构和功能的分析及预测,并对该基因进行克隆,表达及蛋白产物酶学活性研究.从之前对深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的研究得知RruA1084基因编码5-甲酰基-四氢叶酸环连接酶(5-formyltetrahydrofolate cyclo-ligase,也称为次甲基-四氢叶酸合成酶,MTHFS).
M.tuberculosis中Rv0992c基因是Rru A1084的同源物(二者的氨基酸序列具有32.7%的相似性和21.8%的同源性),所以推测前者编码结核分枝杆菌的5-甲酰基-四氢叶酸环连接酶.从GenBank数据库中获得M.tuberculosis H37Rv的Rv0992c的核苷酸序列,设计对引物,以M.tuberculosis H37Rv全基因组为模板,PCR扩增获得Rv0992c基因.通过TA克隆,将PCR产物连接到pMD19-T Simple Vector上,之后亚克隆至载体pET28上,经菌落PCR,质粒酶切以及核苷酸序列测序证明了成功的构建了重组质粒pET28-Rv0992c.
重组质粒转化Escherichia coli BL21(DE3),以温度,时间和IPTG浓度建立三因素三水平的正交实验,优化该重组蛋白质诱导表达条件.以表达条件(0.8mM的IPTG,25℃下诱导4h)进行扩大培养,Ni+凝胶亲和层析柱纯化获得高纯度的重组Rv0992c蛋白.纯化蛋白的酶学活性通过反应产物5,10-次甲基-四氢叶酸在355nm处吸光度的变化得到证实.运用Vector NTI 9,Swiss Model等生物信息学资源对结核分枝杆菌Rv0992c编码蛋白的基本性质进行了分析,包括对蛋白质等电点和,二级结构以及三级结构的预测分析.
结果表明:M.tuberculosis H37Rv Rv0992c基因编码蛋白,理论PI为9.40;二级结构是由3个α螺旋8个β折叠及无规则卷曲构成的.在一二级结构分析的基础上,利用同源建模的方法完成了其三维结构的建模.分析该蛋白在分枝杆菌属中的分布情况,结果显示M.tuberculosis H37Rv的MTHFS同已报道的其他分枝杆菌属来源的MTHFS有较高的同源性.
综上,本研究揭示了M.tuberculosis H37Rv Rv0992c序列编码蛋白具有将5-甲酰-四氢叶酸转化为5,10-次甲基-四氢叶酸的生物学功能.
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