BCA法蛋白定量试剂盒是进行蛋白质浓度测定的最常见的方法之一. BCA蛋白定量的主要原理是:蛋白质在碱性条件下,可以将二价Cu2+离子还原成一价Cu+离子.产生的一价Cu+离子可以与BCA(Bicinchoninic acid)试剂结合,最终生成紫色的复合物.该复合物在562 nm处有很强的吸收峰.复合物的多少与蛋白质的浓度呈接近的线性关系.
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用于Raf激酶抑制蛋白对HCCLM3肝癌细胞乙酰肝素酶表达的抑制作用及其机制研究
以HCCLM3肝癌细胞,空载体转染的HCCLM3肝癌细胞和稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞为研究对象,检测肝癌细胞中RKIP,Hpa,P-ERK的表达情况,进一步明确RKIP抑制肝癌细胞Hpa的表达是否与Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路有关.
方法:1,空载体转染的HCCLM3肝癌细胞,稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞,提取细胞蛋白,BCA法蛋白定量.Westernbloting检测RKIP,P-ERK和Hpa蛋白表达,观察P-ERK,Hpa的表达是否与RKIP的表达有关.
2,HCCLM3肝癌细胞,经稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞,提取细胞蛋白,BCA法蛋白定量.Westernbloting检测RKIP,P-ERK和Hpa蛋白表达,观察RKIP抑制肝癌细胞Hpa的表达是否与Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路有关.
3,HCCLM3肝癌细胞,经稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞加入EGF,激活ERK通路,15分钟后提取细胞蛋白,BCA法蛋白定量.Westernbloting检测RKIP,P-ERK和Hpa蛋白表达,进一步验证RKIP抑制肝癌细胞Hpa的表达与抑制Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路活化有关.
结果:1,RKIP转染组HCCLM3细胞中RKIP的表达明显高于空载体转染组(P<0.05),而P-ERK和Hpa的表达明显低于空载体转染组(P<0.05);随着HCCLM3细胞中RKIP的表达升高,P-ERK,Hpa的表达下降.
2,RKIP转染组HCCLM3细胞中RKIP的表达明显高于空白对照组(P<0.05),而P-ERK和Hpa的表达明显低于空白对照组(P<0.05);随着HCCLM3细胞中RKIP的表达升高,P-ERK,Hpa的表达下降.
3,EGF(+)对照组HCCLM3细胞中P-ERK的表达明显高于EGF(+)RKIP转染组(P<0.05),EGF(+)对照组HCCLM3细胞中Hpa的表达明显高于EGF(+)RKIP转染组(P<0.05);随着HCCLM3细胞中RKIP的表达升高,ERK通路激活后,P-ERK,Hpa的表达仍下降.
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