4EBP1抗体
4EBP1抗体也称为4E-BP1 Antibody,是一种非偶联,抗4EBP1单克隆抗体.它可用于人,小鼠,大鼠,仓鼠背景下的WB,IHC-P,IP实验,并且不带标记. 4EBP1抗体与真核翻译起始因子4E(eIF4E)有直接的相互作用.eIF4E是将40S核糖体亚基募集到mRNA 5'端的多亚基复合物的限制成分.这种蛋白质与eIF4E的相互作用会抑制复合物的装配并抑制翻译.然而,当4EBP1响应于各种信号(包括紫外线照射和胰岛素信号)而被磷酸化时,它会与eIF4E解离,从而激活mRNA翻译. 在肿瘤雷帕霉素耐药性的研究中,4EBP1抗体也扮演了重要角色.雷帕霉素及衍生物能够特异性结合mTORC1并抑制其激酶活性,已被FDA和EMA批准用于肿瘤的临床治疗.然而,多数肿瘤细胞能够产生雷帕霉素耐药性,其中4EBP1的磷酸化与肿瘤细胞的耐药性密切相关.研究发现,阻断PI3K反馈激活或抑制mTORC2活性后能够显著增加4EBP1磷酸化及肿瘤细胞对雷帕霉素的敏感性.
📌 参考资料/链接：
SIRT1:A Key Player in Male Reproduction[J].Khawar Muhammad Babar;Sohail Abdullah Muhammad;Li Wei.Life,2022
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4EBP1抗体可以用于TRIB3通过AKT-mTOR-P70S6K/4EBP1信号通路参与精子发生机制的初步研究
目的(1)验证假性激酶蛋白3(Tribbles homology protein3,TRIB3)与蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)在大鼠睾丸细胞中的蛋白质相互作用关系.(2)探讨TRIB3是否通过TRIB3-AKT-mTOR-P70S6K/4EBP1信号通路调控大鼠精子发生,探究其可能的作用机制.
方法(1)Trib3-/-转基因大鼠的鉴定:将实验室前期采用CRISPR/Cas9技术制备的Trib3全基因敲除Wistar大鼠进行扩繁,待大鼠出生11天后,取鼠尾,提取DNA,采用RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定Trib3-/-转基因大鼠.(2)免疫共沉淀验证TRIB3与AKT在大鼠睾丸细胞中的蛋白质相互作用关系:取野生型成年Wistar大鼠睾丸,利用两步酶消化法消化大鼠睾丸组织,得到大鼠曲细精管单细胞悬液,提取总蛋白,运用4EBP1抗体免疫共沉淀验证在大鼠睾丸中TRIB3与AKT的蛋白质互相作用关系.(3)建立大鼠睾丸组织细胞体外共培养体系:分别取野生型和基因敲除型15-20日龄Wistar雄性大鼠,处死大鼠,无菌取出大鼠双侧睾丸,利用大鼠睾丸体外培养细胞.以培养出的野生型大鼠共培养细胞为对照组,实验组则为Trib3基因敲除大鼠共培养细胞.提取两组细胞的总RNA,反转录成cDNA,qRT-PCR测定精子发生有关标志性基因CDH1,GFRα1,SYCP3和TNP2的表达.(4)qRT-PCR检测信号通路有关基因的表达:分别提取两组细胞的总RNA,反转录成c DNA,qRT-PCR检测两组细胞Trib3基因的表达以及信号通路相关基因AKT,mTOR,P70S6K和4EBP1的表达.(5)4EBP1抗体Western blot检测信号通路有关蛋白的表达:提取两组细胞总蛋白,Western blot分别检测两组细胞TRIB3蛋白的表达以及信号通路有关蛋白AKT和p-AKT,mTOR和p-mTOR,P70S6K和p-P70S6K,4EBP1和p-4EBP1的表达.
结果(1)琼脂糖凝胶电泳结果显示,实验所用雄性Wistar大鼠基因型为Trib3-/-转基因大鼠.(2)利用TRIB3抗体免疫沉淀的蛋白复合物中检测到AKT,同时利用AKT抗体免疫沉淀的蛋白复合物中也检测到TRIB3.(3)成功建立了大鼠睾丸组织细胞体外共培养体系,两组培养体系中均可检测到精子发生不同时期标志性基因的表达.Trib3基因在野生型大鼠共培养细胞中表达,在基因敲除型大鼠共培养细胞中不表达(p<0.05);TRIB3蛋白在基因敲除型大鼠共培养细胞中也不表达.(4)两组细胞均可检测到信号通路基因AKT,mTOR,4EBP1,P70S6K的表达且各基因在实验组中的相对表达水平高于对照组(p<0.05).(5)4EBP1抗体Western Blot检测到两组细胞中均有信号通路相关蛋白的表达,相较于对照组,实验组p-AKT与AKT的比值,p-mTOR与mTOR的比值,p-P70S6K与P70S6K的比值以及p-4EBP1与4EBP1的比值均增高(p<0.05).
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