CALU-3 人肺腺癌细胞

用于细胞膜仿生壳聚糖基纳米载体用于蛋白药物的肺给药治疗研究
以msFGFR2c作为包载的目的蛋白,通过离子交联法制备了载药纳米微粒PCCs/msFGFR2c,并以水溶性季铵盐壳聚糖HTCC构建HTCC/msFGFR2c为对照,测得PCCs/msFGFR2c和HTCC/msFGFR2c的粒径分别在190nm和210nm左右,相应表面电位分别在0.81mV和9.7mV左右.PCCs/msFGFR2c,HTCC/msFGFR2c的包封率分别在47.2%和27.19%左右,载药量分别在9.4%和5.8%左右.原子力显微镜和透射电镜显示纳米粒子形态为类球型.
体外释药试验得出:在24h内,PCCs/msFGFR2c在pH=5.5和7.4的体外环境下释放率分别达到了84%和76%,HTCC/msFGFR2c则分别为76%和70%,表明PCCs纳米系统具有较好的药物缓释功能.体外细胞毒性实验结果表明:当PCCs纳米粒(PCCs-NP)的浓度达到2.0mg/mL时,对MRC-5和Calu-3细胞均无毒性,而HTCC纳米粒(HTCC-NP)的浓度达到0.5mg/mL时就已经对MRC-5和Calu-3细胞有毒性,说明PCCs-NP的生物相容性优于HTCC-NP.
细胞摄取实验结果表明:MRC-5和Calu-3细胞摄取PCCs和HTCC及其纳米载体粒子存在时间和浓度依赖性,在一定摄取时间和摄取浓度范围内呈正相关.荧光纳米载体微粒在亚细胞水平的分布实验得到:在2.0h内被摄入的纳米载体粒子主要分布在细胞Calu-3的细胞质中,在细胞溶酶体内没有观察到纳米载体粒子.以Calu-3细胞建立Transwell呼吸道上皮细胞转运模型.
TEER实验结果显示:在AP端加入浓度为0.125mg/mL的荧光标记PCCs-NP和HTCC-NP纳米载体粒子作用4h,经过24h后TEER值均能够完全恢复,表明两者在该浓度作用4h内对Calu-3细胞单层紧密连接结构的影响是可逆的;但是在AP端加入浓度为0.25mg/mL的荧光标记纳米粒子时,PCCs-NP对Calu-3单细胞层TEER的影响是可恢复,而HTCC-NP对Calu-3细胞单层TEER的影响不可恢复,表明此浓度作用下PCCs-NP对Calu-3细胞单层紧密连接结构的影响是可逆的,而HTCC-NP对Calu-3细胞单层紧密连接结构的影响则不可逆.转运试验结果表明:壳聚糖衍生物PCCs和HTCC制成纳米粒子PCCs-NP,HTCC-NP后,其跨Calu-3细胞单层的转运效率和表观渗透系数Papp都有所提高.
免疫荧光实验表明:在作用浓度为0.25mg/mL时,PCCs-NP对紧密连接蛋白ZO-1的表达几乎没有影响,PCCs和HTCC都能在不同程度上减弱ZO-1的表达,HTCC-NP则能够完全抑制ZO-1的表达,表明两种纳米载体具有不同的跨上皮细胞层机制.建立博来霉素诱导的Wistar大鼠肺纤维化模型,通过肺给药方式研究了负载msFGFR2c的纳米系统对肺纤维化大鼠的疗效.
大鼠的体重,肺组织HE及Massion染色,X光结果都表明PCCs/msFGFR2c纳米系统对肺纤维化有明显的抑制作用,且优于自由msFGFR2c组.总的来说,本研究制备的仿生纳米载体粒子具有良好的生物相容性,可以改善蛋白药物的经肺给药治疗效果,有望成为一种优良的肺给药蛋白药物载体材料.
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