C2C12是由D·Yaffe和O·Saxel建立的小鼠成肌细胞株的亚克隆.C2C12细胞分化很快,容易形成可伸缩的肌管并生成特征性的肌蛋白.用骨形成蛋白2(BMP-2)处理C2C12细胞,会导致C2C12细胞的分化途径从成肌细胞转换为成骨细胞. C2C12作为研究肌肉理想的细胞模型,在实验研究中常诱导其分化为多核肌管.成肌分化在肌肉再生中起重要作用,它是通过一种高度协调的序列程序来产生成熟的骨骼肌的过程.
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C2C12可以用于MOTS-c通过SIRT3诱导C2C12成肌细胞UPRmt的机制研究
MOTS-c是最近发现的一种由线粒体12S r RNA开放阅读框编码的短肽,其主要作用的靶器官是骨骼肌,并且对衰老和SIRT3都具有一定调节作用.
本实验将通过利用鱼藤酮,SIRT3-si RNA,SIRT3过表达和外源性MOTS-c对C2C12成肌细胞进行干预,验证:1)SIRT3是否参与调控骨骼肌UPRmt生物效应;2)SIRT3是否能独立诱发UPRmt;3)MOTS-c是否通过SIRT3诱导UPRmt.研究方法:本研究实验对象为C2C12成肌细胞,研究共分为三部分.
部分验证SIRT3是否参与调控骨骼肌UPRmt生物效应,实验分组为空白对照组(C),SIRT3-si RNA组(si RNA),鱼藤酮干预组(ROT),鱼藤酮+SIRT3-si RNA组(ROT+si RNA);
第二部分验证SIRT3是否能独立诱发UPRmt,实验分组为空质粒组(C),SIRT3过表达质粒组(SIRT3-OE),鱼藤酮阳性对照组(ROT);
第三部分验证MOTS-c是否通过SIRT3诱导UPRmt,实验分组为空白对照组(C),SIRT3-si RNA组(si RNA),外源性MOTS-c孵育组(MOTS-c),MOTS-c+SIRT3-si RNA组(MOTS-c+si RNA).用DCFH-DA探针法检测ROS生成水平.
用JC-1探针法检测线粒体膜电位水平δΨ.用Western-blotting实验方法检测UPRmt的氧化损伤通路中Fox O3a,SIRT3和SOD2;UPRmt的线粒体基质通路c-Jun,CHOP和HSP60;UPRmt的线粒体膜间腔通路AKT,NRF1和OMI以及对MOTS-c相关通路AMPK的蛋白表达水平.
研究结果:
(1) SIRT3是C2C12成肌细胞UPRmt激活的必要条件之一与C组比较,ROT组SIRT3,SOD2,c-Jun,CHOP,HSP60,AKT,NRF1和OMI蛋白表达水平都显著性升高(P<0.05),Fox O3a蛋白表达水平显著性升高(P<0.01).与ROT组比较,ROT+si RNA组HSP60,AKT和NRF1蛋白表达水平显著性降低(P<0.05),Fox O3a,SIRT3,SOD2,c-Jun,CHOP和OMI蛋白表达水平显著性降低(P<0.01).
(2) 单纯过表达SIRT3能激活C2C12成肌细胞UPRmt与C组相比,SIRT3-OE组Fox O3a,SOD2,c-Jun,CHOP,AKT,NRF1和OMI的蛋白表达水平都显著性升高(P<0.05).
(3) 外源性MOTS-c通过SIRT3途径激活C2C12成肌细胞UPRmt与C组比较,MOTS-c组Fox O3a,SIRT3,SOD2,c-Jun,CHOP,HSP60,AKT,NRF1,OMI和AMPK蛋白表达水平都显著性提高(P<0.05).与MOTS-c组相比,MOTS-c+si RNA组c-Jun,CHOP,AKT,AMPK蛋白表达水平显著性降低(P<0.05),Fox O3a,SIRT3,SOD2,HSP60,NRF1和OMI蛋白表达水平显著性降低(P<0.01).
研究结论:1.SIRT3是C2C12成肌细胞UPRmt激活的必要条件之一.
2. 单纯过表达SIRT3亦可激活C2C12成肌细胞UPRmt.
3.外源性MOTS-c可通过SIRT3途径激活C2C12成肌细胞UPRmt.
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