ATT-20细胞是小鼠垂体瘤通过胰蛋白酶分离的成熟细胞系,AtT-20细胞生长时不贴壁,而结成活细胞团.能抗脊髓灰质炎病毒,检测发现肢骨发育畸形病毒(鼠痘)阴性.生长培养基:Ham's F-12K＋15%HS＋2.5%FBS(164210-500)＋1%P/S,培养条件 气相:空气,95%;CO2,5%温度:37℃.
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用于格列卫联合依维莫司对小鼠垂体瘤细胞AtT-20的作用研究
探讨格列卫和依维莫司在小鼠垂体瘤细胞AtT-20中联合作用的效果及可能的分子作用机制,为垂体瘤的联合靶向治疗提供参考.
方法1,主要试剂与仪器格列卫和依维莫司为诺华公司惠赠;AtT-20细胞株购于中国科学院上海细胞所,为悬浮培养细胞;胎牛血清购于Gibco公司;RPMI-1640培养液和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)购自美国Hyclone公司;CO2培养箱购自日本三洋公司;CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所;酶标仪与PCR仪购于美国Thermo Fisher公司;TRIZOL试剂购于美国Invitrogen公司;PCR用引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成;Real-time PCR试剂盒购自TAKARA公司;一抗AKT与p-AKT,ERK与p-ERK,β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗鼠及羊抗兔二抗购于Cell Signaling公司;The ChemiD℃ MP成像仪,电泳槽和转膜仪购于Bio-Rad公司.
2,细胞培养用含100U·mL-1青霉素与100U·mL-1链霉素,10%胎牛血清的RPMI1640培养液,在5%C02,37℃培养箱中培养.每3天离心收集后传代培养,所有实验均采用对数生长期细胞.
3,CCK-8检测细胞增值率及联合指数实验分6组.溶剂对照组;空白对照组;阴性对照组;格列卫处理组(G5,G10,G15,G20,G25µM);依维莫司处理组(E0.1,E1,E10,E100,E200nM);联合用药组(E1+G15,E10+G15,E10+G20);取对数生长期的细胞按1×105个/孔接种于96孔细胞培养板中,不同浓度的依维莫司和格列卫按分组设计依次加入,单独用药处理24,48,72h,联合用药处理72h.每孔加入10%CCK-8于37℃培养4h后置酶联免疫检测仪上测定各孔在波长490nm处的吸光度(A)值.每组设平行孔3个,实验重复进行3次.
计算细胞增殖率:细胞增殖率(%)=(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(阴性对照组吸光度-空白孔吸光度)×100%.计算联合指数(Combination Index,CI)使用Chou-Talalay公式:CI=CA,X/ICX,A+CB,X/ICX,B(CA,X,CB,X分别是联合用药达到X%的药效时,药物A和药物B的浓度;ICX,A’ICX,B分别是单独用药达到相同的药效时,药物A和药物B的浓度),CI等于1表明两药之间以相加的方式相互作用,CI小于1表明两药之间以协同的方式相互作用,CI大于1表明两药之间以拮抗的方式相互作用.
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