BL21(DE3)PLYSS感受态细胞是采用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞,可用于DNA的化学转化.使用pUC19质粒检测,转化效率可达10 7 ,-70℃保存6个月转化效率不发生改变. 基因型:F-,ompT,hsdSB(rB-mB-),dcm,gal(DE3),pLysS,Cmr 质粒转化条件:42℃热激;诱导方法:IPTG;培养基:LB培养基;生长条件: 37℃,有氧;抗性:卡那霉素(15 ug/ml),氯霉素(34 ug/ml).
📄 详细内容
用于大肠杆菌BL21(DE3)感受态制备及转化影响因素的研究
用大肠杆菌细胞制备感受态,然后进行转化实验,已经成为分子生物学实验中频繁应用的一项基础实验手段.制备高效而稳定的大肠杆菌感受态细胞是后续基因克隆,基因表达工作的重要保障,大肠杆菌感受态细胞转化效率的高低,对于后续实验的成败也起到非常重要的作用.
大肠杆菌BL21(DE3)常用作外源基因表达的宿主菌,研究其感受态的制备和转化效率有一定的实际应用价值.大肠杆菌的制备和转化是一个复杂的生物物理和化学反应的过程.不同基因型的菌种,菌体的生长状态,感受态细胞的制备方法和制备条件,转化过程的实验参数,保存技术,质粒的大小等实验因素对转化结果都能产生影响.
对大肠杆菌BL21(DE3)感受态制备和转化的影响因素进行了系统性的研究,并优化了TSS法,掌握了大肠杆菌BL21(DE3)制备及转化实验中需要把控的关键实验参数.
通过本次研究可以得出:(1)保存两年的大肠杆菌BL21(DE3)甘油菌,在LB液体培养基中进行过夜培养,转接活化两次,30℃下,培养2-3小时后的生长状态,是制备感受态的时期;
(2)大肠杆菌BL21(DE3)的转化时期出现在OD600=0.4-0.5时,也就是在对数生长期的中前期.此时,大肠杆菌BL21(DE3)的活菌数目可以达到1×108个/m L;当OD600=0.46时,用CaCl2方法转化p UC19质粒,转化效率可以达到4.6×106 cfu/µg质粒DNA;
(3)用TSS缓冲液对OD600=0.46的大肠杆菌BL21(DE3)进行处理,并制备感受态细胞,在转化体系中加入5×KCM(KCl,CaCl2,Mg Cl2的混合溶液),在复苏过程中加入含有0.2 mol/L葡萄糖的LB培养基,在一定的转化条件下将质粒p UC19转入,其转化效率能够达到1.48×107 cfu/µg质粒DNA;
(4)用优化的TSS法制备感受态并进行质粒转化的实验条件:取培养至OD600=0.46的大肠杆菌BL21(DE3)菌液,在无菌预冷离心管中冰浴30min,4℃,4200r/min离心10 min,收集菌体,加入原菌液量1/10的TSS缓冲液,悬浮细胞并分装至100 ul,保存至-70℃;转化时在感受态细胞中加入质粒5µL,5×KCM 20µL,去离子水75 ul,轻轻混匀,冰浴30 min,室温放置10 min,加入400µL含0.2 mol/L葡萄糖的LB培养基,摇床37℃,180 r/min,复苏40 min;取200µL转化产物涂板并过夜培养12-16小时;
(5)用优化过的TSS法制备感受态,转化pUC19质粒,得到的转化效率是CaCl2方法的3.2倍.
联系我们可以获取更多内容.
如有产品相关项目调研或推广服务, 请致函联系我们