AGL1 ELECTRO感受态细胞
AGL1 ELECTRO感受态细胞是以为C58,RecA型背景,核基因中含有筛选标签—利福平抗性基因rif和羧苄青霉素抗性基因carb,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pTiBo542DT-DNA,此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pTiBo542DT-DNA质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移).
📌 参考资料/链接：
Non-Protein-Coding RNAs and their Interacting RNA-Binding Proteins in the Plant Cell Nucleus[J].Celine Charon,Ana Beatriz Moreno,Florian Bardou,Martin Crespi.Molecular Plant.2010(4)
📄 详细内容
用于油菜花叶病毒(ORMV)126kDa复制酶基因在拟南芥中的可诱导表达研究
RNA干扰是由双链RNA分子介导的,序列特异的转录后基因沉默现象.植物体内的小RNA在植物对抗病毒的RNA干扰机制中起着核心作用,它来自于非蛋白编码RNA的前体.小RNA通过碱基互补配对原则与靶mRNA结合起负调控的作用,利用sRNA抗植物病毒是近年来所研究的一种有效手段.但是病毒为了有效侵染植物,就必须抑制植物体内RNAi机制.
因此,植物病毒同时也能够编码蛋白在RNAi的不同步骤起到抑制作用,这类蛋白被称为基因沉默抑制因子.油菜花叶病毒ORMV作为危害油菜等作物生产的病毒之一,属于烟草花叶病毒属.ORMV基因结构中的复制酶基因表达的126kDa蛋白是一种基因沉默抑制因子.
126kDa复制酶蛋白在体外(in vitro)可结合21nt左右的小RNA,油菜花叶病毒的侵染不仅能引起21nt小RNA的积累,还对该类小RNA的底物mRNA的表达产生了影响.为了进一步验证复制酶蛋白在体内(in vivo)对21nt小RNA的结合富集作用,同时为了更好地了解复制酶蛋白对植物内源转录本的影响,以及其如何通过影响小RNA进而影响小RNA底物mRNA的表达,我们尝试在植物中过量表达该蛋白.但是前期的实验没有获得持续过量地表达该蛋白的植物,这可能是因为过量表达该蛋白对植物有害.
利用植物的可诱导表达技术,在拟南芥中有条件地表达126kDa复制酶蛋白,进而研究ORMV 126kDa复制酶蛋白对植物内源小RNA代谢与功能的影响.这些内源小RNA与植物对病毒侵染的应答有着紧密联系,所以研究这些富集的小RNA类别及作用机制也有助于抗病育种的进一步发展.Silwet-L77是一种非离子型的表面活性剂,常用于植物的转化.研究发现,SilwetL77的加入也可以显著地提高大肠杆菌的转化效率.
同时,比较了不同培养温度,不同培养浓度(OD600值)及不同冷冻保护剂对感受态细胞转化效率的影响.发现,28℃培养E.coli至OD600值为0.55-0.6之间时制备感受态细胞,利用9%的DMSO做为冷冻保护剂冷冻保存感受态细胞,转化时加入1520ppm的Silwet-L77,可以获得最高的转化效率.总之,进一步优化了大肠杆菌感受态细胞的制备方法以及转化方法.
联系我们可以获取更多内容.
如有产品相关项目调研或推广服务, 请致函联系我们