ANTI-TYROSINE HYDROXYLASE
Anti-Tyrosine Hydroxylase是一类可以特异性结合Tyrosine Hydroxylase的多克隆抗体,主要用于检测Tyrosine Hydroxylase的Western Blot,IHC-P,IF,ELISA,Co-IP等多种免疫学实验. 检测原理:双抗体夹心法测定标本中Tyrosine Hydroxylase水平.用纯化的Tyrosine Hydroxylase抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入Tyrosine Hydroxylase,再与HRP标记的Tyrosine Hydroxylase抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色.TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的Tyrosine Hydroxylase呈正相关.用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中Tyrosine Hydroxylase浓度.
📌 参考资料/链接：
New biotech applications from evolved D-amino acid oxidases[J].Loredano Pollegioni,Gianluca Molla.Trends in Biotechnology.2011(6)
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用于酪氨酸羟化酶的表达,纯化及其活性研究
酪氨酸羟化酶是一类以L-Tyr为底物,通过在L-Tyr的苯环上发生邻位羟基化生成L-DOPA的酶,L-DOPA是脑黑质多巴胺生物合成的前体化合物,而多巴胺又是儿茶萘酚,去甲肾上腺素和肾上腺素的前体物质.该酶是这些生物机体重要物质合成的限速酶,对机体的神经系统及中央神经系统具有重要的影响.因此,对酪氨酸羟化酶的研究具有广泛的医学研究价值.
人和大多数动物机体中的酪氨酸羟化酶是以四氢生物喋呤作为其辅因子,只有少数的几种细菌体内的酪氨酸羟化酶是以血红素做为其辅因子,采用的就是一种以血红素b作为其辅因子的酪氨酸羟化酶.该酶来源于S.refuineus,是该菌种合成安曲霉素的限速酶.
1. 通过分子生物学的常规方法构建了酪氨酸羟化酶的pET-28a-Orfl 3的融合表达载体,并对其表达条件诱导温度,溶氧量,诱导剂浓度,以及诱导时间进行了优化,并探究了不同表达条件下对酶活性的影响.得到了该酶的最适表达条件,即25℃,0.1 mM IPTG,装液量为40%,诱导8 h,可以得到相对活性较高的酪氨酸羟化酶.
为了使酶的纯化方法更简单,成本更低,引入了类弹性蛋白纯化标签ELP60,分别将ELP60连在Orf13的C末端和N末端,构建了表达载体pET-Orfl 3-ELP60和pET-28a-ELP60-Orfl3.
并对其对酪氨酸羟化酶的活性影响进行了探究,对其表达条件进行了一定的优化,发现Orfl 3-ELP60的最适表达条件为25℃,0.2 mM IPTG,30%装液量诱导8h可以达到相对活性较高的酪氨酸羟化酶,ELP60-Orfl 3的最适表达条件为30℃,0.1 mM IPTG,40%装液量诱导表达8h可以得到相对活性较高的酪氨酸羟化酶.
并且还发现当ELP60连在Orfl 3的C末端时其相对活性明显高于将其连在Orfl 3的N末端,且其纯化效果也相对较高.因此,试验中活性探索均采用Orfl 3-ELP60为目的蛋白进行研究.
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