C666-1细胞是EBV阳性鼻咽癌细胞系,是来源于阳性鼻咽癌的上皮细胞样贴壁细胞.培养条件为RPMI-1640+10%FBS+1%双抗,生长条件为气相:5%CO2;95%空气温度:37℃.
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用于miR-9下调CXCR4抑制鼻咽癌增殖,侵袭和转移的作用及机制研究
通过5-AZA和TSA处理C666-1细胞后检测miR-9的表达变化和相应编码基因的甲基化状态变化,进而研究miR-9在鼻咽癌中表达失调是否与相应的编码基因启动子区CpG岛DNA甲基化相关,明确miR-9表达失调的分子机制.
通过筛选miR-9过表达的C666-1细胞和体内外功能实验,明确miR-9对鼻咽癌细胞增殖,迁移,侵袭和转移的影响;通过构建和miR-9结合的CXCR4 3’-UTR双荧光报告质粒及上述体内外功能实验,探讨miR-9和CXCR4之间是否存在直接的靶向调控关系,miR-9能否部分逆转CXCR4在鼻咽癌中的生物学功能;
方法1.临床标本收集和分组收集鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织,共60例,包括40例鼻咽癌组织(其中无转移者20例,伴转移者20例)和20例慢性鼻咽炎组织(对照组),患者临床资料齐全,所有标本均行HE染色确诊,同时行miR-9原位杂交检测,并分析其表达与患者临床资料之间的相关性.
2. 鼻咽癌细胞株的培养鼻咽癌细胞C666-1,Sune-1,5-8F,6-10B,CNE-1,CNE-2和Hone-1以RP1640+10%FBS培养,正常的永生化鼻咽上皮细胞NP69以KMSF培养基培养,按常规条件消化传代.
3. Real time-PCR:抽提细胞内小分子RNA和总RNA,逆转录成cDNA后利用Taqman探针或引物进行PCR扩增,以2-δδCt值表示基因相对表达强度.
4. 原位杂交:石蜡组织和细胞爬片经组织脱蜡和水化(4%多聚甲醛固定),胰酶消化(细胞透化),预杂交,杂交,封闭,抗地高辛标记的一抗(1:1000)4℃孵育过夜,BCIP/NBT缓冲液洗涤,BCIP/NBT染色,核固红复染,封片等步骤后,显微镜下观察染色结果,并进行结果判读,判定标准同免疫组化结果的判读.
5.去甲基化药物5-AZA和去乙酰化药物TSA处理C666-1细胞将鼻咽癌细胞C666-1以1×105的密度接种于6孔板中,生长过夜后加入终浓度为50uM的5-AZA,每隔24小时换含上述浓度的5-AZA的完全培养基一次,连续处理3天后收集细胞(5-AZA组),或在连续加入终浓度为50uM的5-AZA作用3天后继续加入终浓度为10nm的TSA维持作用24小时后收集细胞(5-AZA+TSA组),检测miR-9的表达变化和miR-9编码基因的甲基化状态变化.
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