BALB/3T3CLONEA31 小鼠胚胎成纤维细胞

BALB/3T3CLONEA31小鼠胚胎成纤维细胞可以用于体内外感染BALB/c小鼠HCMV分离株UL83,UL54基因遗传变异的研究
将体内外感染BALB/c小鼠人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)分离株UL83,UL54基因进行遗传变异分析,筛选影响病毒跨种属感染的相关基因,为进一步探索其机制提供线索.
方法(1)1.45×106 PFU/ml的HCMV AD169株(本室保存),3×105PFU/ml的山东株(山东医学科学院惠赠)腹腔注射6-8周SPF级BALB/c小鼠1.0ml/只,雌雄各6只作为实验组,同时设立灭活病毒对照组和细胞对照组.一个月后取各组小鼠大脑皮质组织接种人胚胎成纤维细胞(HF)进行病毒分离与鉴定(PCR检测HCMV UL83),RT-PCR检测大脑组织匀浆中HCMV UL54基因的转录.将从小鼠体内分离到的HCMV病毒命名为体内株(下同).
(2) 以MOI=100的HCMVAD169株接种至BALB/c小鼠原代胚胎成纤维细胞(MF)和HF细胞,镜下逐日观察HCMV特征性细胞病变效应(CPE)并传代三次.待出现细胞病变后采用PCR和RT-PCR检测HCMV特异性基因UL83,IE基因的复制和转录.将从MF中分离到的HCMV病毒命名为体外株(下同).山东株,临床分离株接种至HF细胞后进行传代,分别命名为山东株和临床分离株(下同).
(3) 对各分离株提取DNA进行UL83,UL54基因全长的PCR扩增并测序,将得到的序列与其他疱疹类病毒的代表毒株以及MCMV进行比对,经MEGA 4.0软件分析绘制系统发育树.
结果:(1)1.45×106 PFU/ml的HCMV AD169株注射BALB/c小鼠,一月后取大脑皮质组织匀浆直接接种HF,实验组雌性小鼠病毒接种管出现细胞肿胀变圆,胞内颗粒增多,折光性增强.将培养物连续传代三次,仍然可观察到明显CPE.细胞培养物经PCR检测HCMV UL83基因为阳性.大脑组织匀浆直接进行HCMV UL54基因的RT-PCR检测,结果为阳性.3×105PFU/ml的山东株,灭活病毒组,HF对照组,实验组雄性小鼠,上述各项检测均为阴性.
(2) MOI=100HCMV AD169株分别接种至MF细胞和HF细胞后,可观察到MF细胞出现病毒所致CPE,与HF细胞上的CPE相似,细胞培养物均经PCR,RT-PCR检测HCMV UL83,IE基因及其转录产物,结果为阳性.
(3) 四株病毒的UL83,UL54基因序列经Clustal W软件比对分析后发现:UL83基因及其编码氨基酸序列与Genebank公布的HCMV标准株相应序列的同源性在98%-100%之间,UL54基因及其编码氨基酸序列的同源性在99%-100%之间.在发生突变的核苷酸和氨基酸位点中,体内株UL83基因的第682-684位点由CTG突变为TCT,导致第228位氨基酸发生了亮氨酸到丝氨酸的突变.经MEGA4.0软件绘制系统进化树后发现:能够适应小鼠体内环境,并感染小鼠大脑皮质的HCMV,其UL83基因在进化树上处在另一独立的支群内,其余各株的UL83基因与标准株,Merlin,Towne处于同一支群.四株病毒的UL54基因处在同一支群.结论从体内外感染HCMV的BALB/c小鼠大脑组织与原代MF中分离得到了能在小鼠大脑组织与细胞中增殖复制的HCMV毒株.
通过对各个毒株UL83,UL54基因全长的PCR扩增并测序,比对分析后发现:体内株UL83基因编码的氨基酸序列在228位发生了突变,而此位点具有诱发细胞毒性T细胞(cytotoxic Tlymph℃yte CTL)反应的潜力.经进化关系分析后发现能够适应小鼠体内环境,并感染小鼠大脑皮质的HCMV AD169株,其UL83基因在进化树上处在另一独立的支群内.提示HCMV pp65蛋白CTL表位序列的突变可能与HCMV宿主改变有关,此项结果为进一步研究HCMV跨种属感染机制提供了线索.
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