BHT101

BHT101可以用于青蒿琥酯调控E2F1抑制甲状腺癌增殖和侵袭的机制研究
通过研究青蒿琥酯对甲状腺癌细胞的影响,建立裸鼠移植瘤模型,在体外和体内探讨青蒿琥酯对甲状腺癌的抗癌作用,并探究其作用机制,拟为甲状腺癌患者预测淋巴结转移和预后评估提供新的可靠依据,并为肿瘤转移调控模式提供新的思路和完善依据,为开发新型治疗策略提供理论依据.
方法:1.体外实验(1)青蒿琥酯对甲状腺癌细胞增殖的影响.用20µM,40µM,80µM的青蒿琥酯处理甲状腺癌BHT101和TPC1细胞24h,同时设立阴性对照组.通过CCK-8实验检测ART对BHT101和TPC1细胞增殖活力的影响.通过Ed U(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)实验和克隆形成实验进一步检测ART对BHT101和TPC1细胞增殖的影响.通过流式细胞术检测ART对BHT101和TPC1细胞周期和细胞凋亡的影响.通过Western-blot实验检测ART对BHT101和TPC1细胞迁移相关蛋白E-钙粘蛋白,N-钙粘蛋白和波形蛋白表达的影响.通过划痕实验检测ART对BHT101和TPC1细胞迁移能力的影响.通过Transwell实验检测ART对BHT101和TPC1细胞侵袭能力的影响.
(2) 青蒿琥酯对甲状腺癌细胞作用机制的研究.对青蒿琥酯处理的细胞及对照组细胞进行m RNA转录组二代测序,每组做三个平行.通过生物信息学对基因表达进行分析,筛选差异基因并富集基因,进行通路富集分析,同时进行GSEA分析.通过网络药理学分析进行分子对接寻找ART作用靶蛋白.
2. 体内实验(1)4周龄的雌性BABL/c裸鼠,适应性喂养1周,将TPC1细胞(2×107)皮下注射到裸鼠中,建立甲状腺癌异种移植裸鼠.将小鼠随机分为对照组和给药组,给药组小鼠进行灌胃给药,对照组小鼠给予生理盐水灌胃,一周后观察成瘤情况.每两天监测一次小鼠的肿瘤生长,5周后断颈处死裸鼠,在小鼠死亡后解剖取材,称重并进行后续实验.
3. 肿瘤组织行免疫组化Ki-67染色和Tunel染色,确定肿瘤细胞增殖指数和凋亡率.提取肿瘤组织的蛋白,利用Western-blot检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白bax,bcl-2,RAPR的蛋白表达水平.同时通过Western-blot检测肿瘤组织中E2F1相关蛋白E2F1,c-Myc,Cyclin E的表达水平.
结果:1.体外实验(1)加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1细胞的OD值均降低,且青蒿琥酯剂量依赖性降低BHT101和TPC1细胞的OD值,青蒿琥酯剂量依赖性降低BHT101和TPC1细胞的细胞活力.加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1细胞克隆集落数均减少,其中,低浓度(20µM)青蒿琥酯明显减少克隆集落数(P<0.05),中浓度(40µM)和高浓度(80µM)对克隆集落数形成的抑制能力更强(P<0.001),表明青蒿琥酯具有降低BHT101和TPC1细胞的增殖的能力.Ed U实验结果显示青蒿琥酯作用后Ki-67阳性数量减少,随着青蒿琥酯浓度的增加,Ki-67阳性细胞数量呈递减趋势.统计结果显示,青蒿琥酯抑制BHT101和TPC1细胞的增殖能力,且呈剂量依赖性.
划痕实验结果显示,青蒿琥酯孵育BHT101和TPC1细胞24小时后,与对照组相比,划痕面积增加,且随着青蒿琥酯浓度增加划痕面积逐渐增加,表明青蒿琥酯降低BHT101和TPC1细胞的迁移能力.Transwell结果显示,青蒿琥酯孵育BHT101和TPC1细胞24小时后,与对照组相比,通过Transwell小室的细胞数量减少,呈剂量依赖性.结果显示ART降低BHT101和TPC1细胞的侵袭能力.此外,进一步通过Western-blot检测迁移相关蛋白的表达,从蛋白水平检测青蒿琥酯对甲状腺癌细胞迁移的影响.
结果显示,与对照组相比,随着青蒿琥酯浓度的增加,BHT101和TPC1细胞中E-钙粘蛋白表达增加,同时,波形蛋白和N-钙粘蛋白表达下降.进一步统计分析显示青蒿琥酯剂量依赖性地增加E-钙粘蛋白表达,抑制波形蛋白和N-钙粘蛋白表达(P<0.05).通过流式细胞术分析可以看出,与对照组相比,加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1细胞凋亡的比率增加(P<0.01),呈剂量依赖性.
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