D407

D407可以用于HIV-1进入视网膜色素上皮细胞及其传播的研究
通过体外培养的D407细胞,建立体外的视网膜上皮细胞屏障模型.利用流式细胞技术,western blotting,共聚焦显微镜等多种方法研究病毒进入D407细胞,采用化学抑制剂的方法探讨病毒进入D407细胞的具体机制,采用PCR技术检测病毒在D407细胞中的整合作用,利用溶酶体的标记物和溶酶体中的蛋白酶抑制剂等检测病毒在细胞内的转运过程;最后通过共培养的方式来检测病毒在细胞-细胞间的传播.
本文旨在探讨HIV-1进入视网膜色素上皮细胞的机制以及病毒进入细胞后发生的分子事件.预期阐明病毒致视网膜疾病的机制及病毒在视网膜中可能建立的潜伏感染,寻找潜在的药物治疗靶点.
研究方法:1.克隆病毒的制备及其感染力的检测1)将SF162(R5受体嗜性)病毒全长基因的质粒和NL4-3(X4受体嗜性)病毒全长基因的质粒,分别转染至293TX细胞中制备感染性克隆病毒.2)将转染得到的HIV-1克隆病毒分别稀释2,4,8,16,32,64倍六个浓度,100分µl/孔,加入到提前12h铺好的TZM-B1细胞的96孔板中,48 h后用luciferase报告基因检测试剂盒检测.
2. 检测D407细胞表面受体的表达1)流式细胞仪检测:D407铺板36 h后,用0.025%的EDTA消化细胞,PBS重悬,1µg/ml anti-CD4,anti-CCR5,anti-CXCR4的抗体4℃孵育1 h,1µg/ml的鼠源性二抗4℃孵育40min,PBS重悬后,流式细胞仪检测.2)RT-PCR检测:依据基因组试剂盒的说明书,提取D407细胞的基因组,参考文献设计CD4,CXCR4,CCR5等受体基因的引物序列,基因组直接进行RT-PCR实验,用7500软件查看各样品的溶解曲线和循环数.
3. 检测HIV-1能否感染D407细胞1)ELISA检测(以R5受体嗜性的病毒为例):将病毒处理CEMX1745.25M7细胞和D407细胞6 h,胰酶消化收集细胞,PBS洗涤3次,培养基重悬,1×105个/孔铺板,分别在第1,3,5,7天取500µ1上清裂解,用ELISA检测上清中p24的含量.
4. 检测HIV-1能够进入D407细胞1)流式细胞仪检测:将D407细胞2×105个/孔铺板,12 h后加入EGFP标记的HIV-1,37℃孵育2 h,胰酶消化,重悬,PBS混悬均匀,上机检测.2)Western blotting检测:将D407细胞2×105个/孔铺板,24 h后分别加入不同的HIV-1,37℃孵育2 h,胰酶消化,重悬,离心,PBS洗涤3次,用细胞裂解液RIPA裂解,收集蛋白,检测核心抗原p24蛋白.3)共聚焦显微镜检测:将D407细胞2×105个/孔铺板,24 h后分别加入EGFP标记的克隆病毒,37℃孵育1h,PBS洗涤3次,加入2 gM的DiI(染细胞膜的红色荧光染料)染色10min,PBS洗涤3次,4%的多聚甲醛固定15 min,PBS洗涤3次,DAPI染细胞核,在荧光共聚焦显微镜上观察不同荧光所在的位置.
5.HIV-1进入D407细胞的机制研究1)流式细胞仪检测:将D407细胞2×105个/孔铺板,孵育24 h后,分别加入不同的化学抑制剂处理细胞1 h,加入EGFP标记的R5受体嗜性的克隆病毒,处理1 h,胰酶消化,重悬,PBS混悬均匀,上机检测.2)Western blotting检测:将D407细胞2×105个/孔铺板,孵育24 h后,加入不同浓度的各种抑制剂,处理1 h,加入克隆病毒,处理1 h,胰酶消化,重悬,离心,PBS洗涤3次,用细胞裂解液RIPA裂解,收集蛋白,检测核心抗原p24蛋白.
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