A-427 人肺腺癌细胞系

A-427人肺腺癌细胞系可以用于GRK6基因在肺腺癌中的作用及机制研究
明确人肺腺癌中GRK6基因的表达情况及其与临床病理参数之间的关系,阐明GRK6在肺腺癌中表达下调的可能原因以及转录因子C/EBPa对其相关调控机制,探讨C/EBPa/GRK6信号通路在肺腺癌细胞迁移侵袭中的作用.
研究方法:1,用免疫组化法测定包含122例肺腺癌和45例正常肺组织的组织芯片GRK6基因蛋白表达,蛋白免疫印迹检测18例新鲜肺腺癌组织标本和邻近的非癌肺组织标本的蛋白表达,qPCR测定20例新鲜肺腺癌患者癌组织中及匹配的邻近的非癌肺组织标本中GRK6基因的mRNA.统计分析GRK6蛋白表达水平与相关临床病理参数及预后的关系;
2,应用甲基化特异性PCR和亚硫酸氢盐测序PCR检测54例肺腺癌临床标本中GRK6基因启动子区的甲基化状态,分析GRK6基因启动子区的甲基化状态与临床病理参数及预后的关系,并应用亚硫酸氢盐测序PCR检测肺癌细胞系A549,A-427人肺腺癌细胞系,H1299和支气管细胞系16HBE中GRK6基因启动子区的甲基化状态,进一步应用甲基化转移酶抑制剂处理肺癌细胞后观察GRK6基因表达水平的变化;
3,应用生物信息学及染色质免疫共沉淀技术探索并验证可能参与调控GRK6基因表达的转录因子C/EBPa,利用野生型和突变型的GRK6启动子构建重组质粒,并进行荧光素酶报告基因检测以研究C/EBPa与GRK6可能的结合位点对GRK6基因转录的影响.利用染色质免疫共沉淀技术检测肺腺癌组织和邻近的非癌肺组织中C/EBPa和GRK6基因启动子之间的结合情况.对肺癌细胞系A549应用5-氮杂-2’-脱氧胞苷进行去甲基化处理,染色质免疫共沉淀法检测C/EBPa和GRK6基因启动子区结合变化情况;
4,通过沉默及过表达C/EBPa观察GRK6的表达,通过沉默及过表达GRK6观察肺腺癌细胞迁移与侵袭能力的变化,调控肺癌细胞A549及H1299的GRK6表达水平观察EMT相关标记物E-钙黏蛋白和波形蛋白水平的变化,过表达肺癌细胞A549的GRK6水平,观察MMP2,MMP7水平的变化.
研究结果:1,GRK6基因表达水平在肺腺癌组织中显著下调,GRK6阳性染色主要位于肺腺癌细胞的细胞质中.GRK6表达水平与肺腺癌患者的临床分期及肿瘤组织病理分级显著相关,但与性别,年龄,吸烟史,肿瘤大小,淋巴结状态等临床病理参数无显著相关性;Cox比例风险模型多变量分析显示,GRK6表达(P=0.004)和病理分级(P<0.001)是患者总生存期的独立预后指标.Kaplan-Meier生存分析表明,GRK6的低表达与肺腺癌患者总体生存率差有显著相关性(P<0.001);
2,MSP发显示54例肺腺癌患者中有42例患者的癌组织GRK6启动子区甲基化为高甲基化和部分甲基化,并且甲基化水平与病理分化程度有相关性(P=0.024),但GRK6启动子区甲基化水平与年龄,性别,吸烟情况,淋巴结转移和肿瘤分期无相关性;Kaplan-Meier生存分析显示,在不同甲基化水平的三组患者之间其OS存在差异(P=0.027),但是在无甲基化和部分甲基化组间的OS没有差异(P=0.492);BSP方法检测发现肺腺癌组织和邻近非肿瘤组织GRK6基因启动子区CpG位点的甲基化频率分别为52±7.8%和23±6.5%,肺腺癌组织GRK6基因启动子区甲基化水平明显高于邻近非肿瘤组织;
3,GRK6基因在肺癌细胞系A549和A-427人肺腺癌细胞系中的mRNA水平明显低于支气管细胞系16HBE,GRK6在肺癌细胞系H1299中的mRNA水平与16HBE细胞相比无差异,进一步应用BSP检测上述四种细胞系中GRK6基因启动子区的甲基化水平显示为:A549细胞系中GRK6基因启动子区域的甲基化程度为(63.9%),在A-427人肺腺癌细胞系中为(56.7%),在H1299细胞系中(26.7%)及16HBE细胞系中甲基化程度较低(15.6%);采用5-氮杂-2’-脱氧胞苷对肺癌细胞进行去甲基化处理后,A549和A-427人肺腺癌细胞系细胞中GRK6表达上调;
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