A2780

A2780可以用于基于高通量测序对外泌体调节卵巢癌细胞株A2780顺铂耐药性相关miRNA的筛选,鉴定及功能研究
探讨卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP细胞上清来源的外泌体对其亲本细胞株A2780的影响,筛选并鉴定A2780/DDP和A2780细胞上清液中外泌体mi RNA的差异,寻找与卵巢癌顺铂耐药相关外泌体mi RNA靶点,同时在卵巢恶性肿瘤中初步探索外泌体mi RNA的相关功能及作用.
方法:1.超速离心法或试剂盒法获得A2780/DDP细胞上清来源外泌体;透射电子显微镜直接观察细胞上清提取物的形态和大小;纳米粒径分析仪检测细胞上清提取物的粒径大小;Western Blot检测细胞上清提取物表面标记蛋白指标CD63,CD9,Ep CAM及Annexin V的表达情况.
2. 将提取的A2780/DDP细胞上清来源外泌体与A2780细胞株共培养后,Western Blot检测p62,LC3-I及LC3-II等自噬相关蛋白在处理后的A2780细胞株中的表达水平;CCK8法检测处理后的A2780细胞存活率;免疫荧光显微镜观察Dil染色后的A2780/DDP细胞上清来源外泌体在Dio染色后的A2780细胞株中的摄取情况.
3. 提取A2780及A2780/DDP细胞上清来源外泌体,差异性外泌体mi RNA表达谱使用高通量测序(HTS)技术检测;相关外泌体mi RNA的靶基因使用mi RDB及Targetscan在线数据库预测;外泌体mi RNA相关功能及通路分别利用GO及KEGG数据库预测.
4. RT-q PCR验证3个在A2780/DDP中上调的外泌体mi RNA表达情况;外泌体mi RNA的关键靶基因通过PPI网络预测;卵巢癌hsa-mi R-675-3p和IC50的相关性通过GDSC数据库联合TCGA数据库预测;从UCSC-Xena平台提取卵巢癌样本,联合GENCODE数据库构建mi RNA-m RNA网络;R语言联合ESTIMATE,GSVA,CIBERSORT,MCPcounter及x Cell等5种算法预测hsa-mi R-675-3p与卵巢癌免疫微环境的相关性.
结果:1.透射电子显微镜结果显示A2780/DDP细胞上清提取物呈囊泡状,且直径在40-120nm;纳米粒径仪检测结果显示细胞上清提取物的直径在40-120nm;Western blot结果显示细胞上清提取物蛋白指标CD63,CD9,Ep CAM,Annexin V的表达均有明显增强的趋势.
2. A2780/DDP细胞上清来源外泌体与A2780细胞株共培养48h后:Western Blot显示与A2780对照组(未添加外泌体共培养)相比,A2780实验组(添加外泌体共培养)P62,LC3-I及LC3-II等自噬相关蛋白的表达水平均有增加趋势;CCK8结果显示A2780实验组48h的顺铂IC50有一定变化;免疫荧光实验结果显示A2780细胞株可摄取A2780/DDP细胞上清来源的外泌体.
3.HTS结果显示:A2780及A2780/DDP细胞上清来源的外泌体中,103个mi RNA表达上调,23个mi RNA表达下调(DE-mi RNAs的识别阈值存在两倍及以上的变化,P<0.05).筛选10个在卵巢癌顺铂敏感细胞株A2780/DDP细胞上清中上调的外泌体mi RNA,利用在线数据库mi RDB及Targetscan预测下游靶基因,外泌体hsa-mi R-675-3p下游靶基因可使用Venny图归类.GO分析结果显示:生物过程(BP)包括细胞过程,发育过程及解剖结构发育等方面;细胞组成(CC)包括细胞过程,发育过程及解剖结构发育的调控等方面;分子功能(MF)体现在蛋白质结合,转录活性及DNA结合等方面.KEGG分析结果显示:PI3K-Akt信号通路,Wnt信号通路,Erbb信号通路等可能参与了卵巢癌耐药的过程.
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