AGL1 Electro感受态细胞是以为C58,RecA型背景,核基因中含有筛选标签—利福平抗性基因rif和羧苄青霉素抗性基因carb,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pTiBo542DT-DNA,此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pTiBo542DT-DNA质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移).
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AGL1感受态细胞可用于农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物检测研究:
在实验室已初步建立的农杆菌EHA105介导银耳转基因方法的基础上,以银耳潮霉素敏感菌株Tr21-01为出发菌株,通过冻融法将携带有潮霉素磷酸转移酶(Hph)基因为遗传标记及人胰岛素基因(BAC)为目的基因的质粒pBHg-BCA导入根癌农杆菌GV3101,LBA4404和AGL-1中,并进一步介导转化银耳进行研究.
实验结果发现:AGL-1具有较高的转化率;GV3101转化率较低,且假阳性较高;LBA4404无抗性菌落长出.此结果表明不同的农杆菌侵染银耳芽孢能力具有差异性,且对受体侵染具有一定的特异性.本实验以农杆菌EHA105为参照菌株,对农杆菌AGL-1介导转化银耳进行研究.基于农杆菌介导转基因受诸多因素的影响,本实验从农杆菌与银耳芽孢共培养时间,银耳芽孢浓度,农杆菌浓度,诱导剂乙酰丁香酮(AS)的浓度,转化菌株阳性比率等方面进行优化.
其转化条件优化结果为:AGL-1菌液OD值为0.4-0.5,AS诱导培养浓度为250µg/mL,共培养浓度为150µg/mL,银耳芽孢浓度为10-8/mL,共培养72h转化率最高,可达500个/10-8,且阳性菌落为89%;EHA105菌液OD值为0.4-0.5,AS诱导培养浓度为200µg/mL,共培养浓度为200µg/mL,银耳芽孢浓度为10-8/mL,共培养48h转化率最高,可达380个/10-8,且阳性菌落为83%.通过比较发现AGL-1比EHA105有更高的转化率.
通过上述转基因方法,我们筛选到大量转化子,随机挑选26株转化子通过ITS,Hph基因及BCA基因进行DNA水平验证,同时随机选取6株进行Hph基因和BCA基因的cDNA水平验证.实验结果表明:我们选取的转化子都为阳性菌株,并且检测到Hph基因和BCA基因的mRNA.通过对60株转基因菌株利用ELISA法对BCA目的基因进行初步检测,结果表明部分菌株可以检测到表达目的BCA基因的表达产物.进一步分析我们检测得到的有目的BCA基因表达菌株发现,其潮霉素抗性很高,大部分潮霉素抗性达350µg/mL.此结果说明目BCA基因的表达与抗性基因Hph表达存在一定关系.
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