3型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P3)ELISA试剂盒

用于S1P3 siRNA对自发性高血压大鼠勃起功能的影响研究
探讨携带S1P3 siRNA慢病毒载体阴茎海绵体内注射的方式进行转染能否通过影响S1P3,eNOS,R℃K1,R℃K2蛋白表达,改善自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rat,SHR)大鼠勃起功能.目前尚无在体实验研究S1P3 siRNA对阴茎组织RhoA/Rho激酶信号通路的作用,并且携带S1P3 siRNA慢病毒载体对勃起功能的影响目前亦不清楚.
故本次实验先成功构建慢病毒转染模型,通过阴茎海绵体内注射的方法进行转染,从而在动物活体水平,验证携带S1P3 siRNA慢病毒载体对SHR大鼠阴茎海绵体组织S1P3,eNOS,R℃K1,R℃K2蛋白表达及勃起功能的影响.方法:本次实验所用动物均为12周龄健康雄性大鼠,分组:正常血压对照组(A组):5只WKY,将15只SHR随机分组(每组5只):SHR阳性病毒组(B1组);SHR阴性病毒组(B2组),剩下的为C组.会阴部备皮消毒后用适当浓度的巴比妥钠麻醉.暴露阴茎海绵体中部,B1组注射siRNA阳性病毒(滴度1×108),每侧10ul,B2组相同部位注射等剂量等滴度的阴性病毒,每侧10ul.
饲养一周后,在机能实验室内,称重并采用前述方法进行腹腔麻醉.大鼠手术台上用橡皮筋,尼绒线固定四肢,尾巴,并于阴囊根部打结.打开腹腔暴露下腹腔的膀胱,精囊等组织,盆神经节(major pelvic ganglion,MPG)位于前列腺,直肠沟内.游离并暴露左侧颈总动脉.启动RM6240程序,肝素生理盐水肝素化所有管道,定标,调零后在同一水平线静脉留置针置于左侧颈总动脉,24G细针头穿刺阴茎海绵体远端,穿刺时避开龟头,先右侧后左侧,从远端向近端穿刺,避免血肿.穿刺成功后,程序自动显示瞬时海绵体内压(Intral Cavernosum Pressure),即刻有创动脉血压(Intral Arterial Pressure),平均动脉压(Mean Arterial Pressure).ICPmax/MAP代表勃起指数.数值平稳后行电刺激,在程序中设置电压,波幅,频率等参数:0V,3V,5V,5ms,12Hz.
电刺激器正极尖端接触MPG.在三个电压下,刺激约45s,休息约5min.各组大鼠ICPmax/MAP值测量完毕后,冻存管收集阴茎海绵体标本,液氮浸泡后于-130度冰箱冻存;通过静脉留置针采心脏血,暂常温保存于离心管,待各组大鼠心脏血采集完毕后,统一离心取血清,用于睾酮(tesosterone,T)水平检测.随机取每组大鼠阴茎海绵体部分组织用于冰冻切片至截面积,裱于玻片中央后在避光室内进行DAPI染色.打开cellsence系统,共聚焦荧光显微镜,“1”通道下激发光为紫外光,视野中的蓝点为细胞核;“4”通道下激发光为蓝光,视野中的绿点为GFP表达阳性的细胞核.高倍镜下同一组织片同一视野中总绿点数除以总蓝点数即转染率(Transfective Index,TI).免疫组化,Western-blot,RT-qPCR检测S1P3,R℃K1,R℃K2,eNOS mRNA及蛋白在大鼠阴茎海绵体中的表达.
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