17羟孕酮(17-OHP)ELISA试剂盒

用于新生儿17α-羟孕酮和总半乳糖测定试剂及妊娠相关蛋白A(PAPP-A)质控品的研制
拟制备质量可靠,价格低廉,可长期稳定供应的PAPP-A质控品.同时,在不同试剂上测定该质控品和血清样本,以考察各试剂间PAPP-A测定值是否具有可比性.
方法:新生儿17a-羟孕酮检测试剂(时间分辨免疫荧光法)的反应原理为竞争抑制法.采用羊抗兔IgG的多克隆抗体(二抗)包被反应板,捕获定量加入的17a-羟孕酮抗体(一抗),检测时加入校准品或待测样品和铕标记17a-羟孕酮抗原,样品中的17a-羟孕酮和铕标记17a-羟孕酮抗原竞争结合被二抗捕获的一抗,形成二抗-一抗-铕标记17a-羟孕酮抗原复合物.当铕在增强液中从复合物上解离后发出强的荧光,荧光强度与样品中的17a-羟孕酮浓度成反比.本研究以脱纤维绵羊全血作为校准品,质控品配制用基质.具
体过程是:采用17a-羟孕酮抗原配制校准品,以17a-羟孕酮欧洲标准品为对照,在PE公司17a-羟孕酮试剂盒上进行校准品的标定.标定后的校准品浓度分别为Ong/ml,1.3ng/ml,3.2ng/ml,7ng/ml,25ng/ml和100ng/ml.通过本底荧光值及剂量-反应曲线范围,相关系数等指标,确定包被板,包被体积等条件;对二抗和一抗进行两两配对比较;选择抗原偶联物进行铕标记并纯化;对不同稀释比例的标记抗原偶联物与不同浓度的二抗进行配对实验等.
新生儿总半乳糖定量测定试剂(荧光分析法)的反应原理是:滤纸干血片中的总半乳糖在半乳糖脱氢酶的催化作用下,与NAD反应,生成半乳糖内酯和NADH.用荧光检测仪在激发波长355nm和发射波长460nm条件下,测定生成物NADH的荧光强度,其荧光强度与总半乳糖的浓度成正比.
以脱纤维绵羊全血作为校准品,质控品配制用基质.采用半乳糖-1-磷酸配制校准品,通过芬兰Labsystem公司新生儿半乳糖检测试剂盒(荧光分析法)进行标定,标定后的校准品浓度依次为:Omg/dl,5mg/dl,10mg/dl,20mg/dl,40mg/dl,60mg/dl.
采用本底荧光值及剂量-反应曲线范围,相关系数等指标,选择合适的包被板和主要原材料,选择碱性磷酸酶:半乳糖脱氢酶:NADH混合反应液配比,并对铜试剂的各反应条件进行优化,如硫酸铜溶液的不同稀释比例(1:10000,1:1000,1:100和1:10),碳酸钠-酒石酸钾钠缓冲液和硫酸铜溶液的不同比例(3:2,1:1,2:1);对试剂加样体积和反应时间进行研究.
通过上述研究,选定了这两种自制试剂的主要原材料,确定了基本的反应模式和生产工艺流程;然后进行中试生产,并对自制试剂进行分析性能评价,包括最低检测量,准确性,剂量-反应曲线的相关系数,精密度,特异性,抗干扰实验,HOOK效应,稳定性等性能评价.
通过健康新生儿血片样本测定值,文献资料及临床现行参考值范围,设定自制试剂的正常参考值范围;采用对照试剂与自制试剂对血清样本同时进行检测,计算两种方法测值的一致性,以考核自制试剂的临床检测性能.PAPP-A质控品的研制:收集孕晚期孕妇血清为原料,以正常人血清稀释至三水平目标浓度,加入防腐剂,经无菌过滤,充分混匀后,按0.5ml/瓶进行分装,冻干制备得到PAPP-A质控品,于-20℃保存.
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