C8-D1A源自出生8天小鼠小脑组织,由B Pessac,D Trisler建立.该细胞具有小神经胶质细胞特征.该细胞为GFAP阳性细胞,除此之外,没有检测到其它神经胶质神经元或小神经胶质细胞的分子标记.C8-D1A细胞具有类似于原代星形胶质细胞的形态和生理特征,可以用于研究星形胶质细胞的生长,分化及功能.
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C8-D1A可以用于海人酸(KA)诱导星形胶质细胞NLRC4炎症小体活化及ε-viniferin的干预研究
通过KA诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A,分析NLRC4炎症小体活化在KA诱导后的星形胶质细胞相关神经炎症中的作用及ε-viniferin的干预效应,为发现癫痫形成过程中星形胶质细胞神经炎症的关键分子及其干预策略提供理论和实验依据.
研究方法1,分析KA对小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体活化及下游信号蛋白Caspase-1和炎症因子IL-1β表达的影响:(1)KA作用浓度与时间筛选:用不同浓度的KA(10µm,25µm,50µm,100µm)诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 24h(KA-50µm组增加48h作用时间点),对照组加入等量的完全培养基培养24h与48h通过CCK8检测各组细胞存活率;通过ELISA检测不同KA作用浓度及时间点下各组细胞IL-1β的分泌量;
(2) 采用50µm KA或完全培养基诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 48h后,通过Western blotting检测细胞中标记物胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP),NLRC4,Caspase-1/P20/P10和Cleaved-IL-1β蛋白的表达.
2,分析沉默NLRC4的表达对KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4,Caspase-1,IL-1β表达的影响:
(1) 向小鼠星形胶质细胞株C8-D1A转染沉默NLRC4基因的短发卡RNA(NLRC4 shRNA)慢病毒载体(sh-NLRC4组)或作为阴性对照的Vehicle shRNA慢病毒空载体(sh-CON组),通过荧光显微镜观察NLRC4 shRNA慢病毒是否成功感染小鼠星形胶质细胞株C8-D1A;通过RT-qPCR及Western blotting检测NLRC4 shRNA慢病毒对小鼠星形胶质细胞株C8-D1A内NLRC4表达的抑制效应;
(2) 应用NLRC4 shRNA慢病毒或Vehicle shRNA慢病毒转染小鼠星形胶质细胞株C8-D1A,加用50µm KA诱导48h,分为四组;sh-CON组,sh-CON+KA-50µm组,sh-NLRC4组,sh-NLRC4+KA-50µm组.分别通过Western blotting及ELISA法检测各组细胞中NLRC4及Caspase-1/P20/P10,Cleaved-IL-1β蛋白的表达及IL-1β的分泌.
3,分析ε-viniferin对KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体活化及Caspase-1,IL-1β表达的影响:(1)应用1µmε-viniferin作用小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 24h,分为三组:control组,溶剂对照DMSO组,vinifelin组.通过CCK8检测各组细胞存活率;(2)应用50µm KA诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 48h,加用1µmε-viniferin预处理24h,分为四组:control组,KA组,vinifelin+KA组,vinifelin组.分别通过Western blotting及ELISA法检测各组细胞中NLRC4及Caspase-1/P20/P10,Cleaved-IL-1β蛋白的表达及IL-1β的分泌.
结果1,KA对小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体活化及下游信号蛋白Caspase-1和炎症因子IL-1β表达的影响:(1)KA作用浓度与时间筛选:小鼠星形胶质细胞株C8-D1A经不同浓度KA诱导24h后,KA-10µm组,KA-25µm组,KA-50µm组细胞存活率均较KA-0µm组显著增高(P<0.05),且以KA-10µm组,KA-25µm组更为明显(P<0.01),而KA-100µm组细胞存活率较KA-0µm组显著下降(P<0.01);KA-50µm组,KA-100µm组培养液中IL-1β分泌量较KA-0µm组显著增高(P<0.01),且KA-50µm-48h组条件性培养液中IL-1β分泌量较KA-0µm-48h组及KA-50µm-24h均存在显著增高(P<0.01);(2)Western blotting结果显示,与对照组相比,KA-50µm组细胞内GFAP蛋白表达较明显升高(P<0.05);与对照组相比,KA-50µm组NLRC4,下游信号蛋白Caspase-1活性体Caspase-1/P20/P10,炎症因子IL-1β剪切体Cleaved-IL-1β蛋白表达均明显升高(P<0.01).
2,沉默NLRC4的表达对KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4及Caspase-1,IL-1β表达的影响:(1)NLRC4 shRNA慢病毒转染小鼠星形胶质细胞株C8-D1A后15d,嘌呤霉素1µg/ml筛选7d后,可在荧光显微镜下观察到,与明场下细胞形态对比,小鼠星形胶质细胞株C8-D1A内存在明显绿色荧光分布;RT-qPCR结果显示,sh-NLRC4组NLRC4 mRNA相对表达量较sh-CON组下降88.12%,差异具有统计学意义(P<0.01);Western blotting结果显示,sh-NLRC4组NLRC4蛋白的表达水平较sh-CON组显著降低(P<0.05).
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