AH109感受态细胞

AH109感受态细胞可用于STAT4,STAT6与CBP相互作用及其关键结构域的检测:
构建STAT4,STAT6的酵母表达质粒和CBP的诱饵表达质粒,并检测诱饵蛋白的毒性,渗漏和自激活作用,为酵母双杂交检测STAT4,STAT6与CBP的相互作用做准备.方法:PCR扩增小鼠的STAT4,STAT6和CBP基因,分别克隆入酵母双杂交系统的AD和BD载体,测序正确后,将上述质粒分别转化酵母AH109细胞,提取细胞蛋白,western blot检测蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白CBP的毒性,渗漏和自激活作用.
结果:成功扩增了小鼠的STAT4,STAT6和CBP基因,并分别正确克隆入AD和BD载体,测序结果符合要求,western blot证实上述蛋白均能在AH109中正确表达,诱饵蛋白CBP对酵母AH109细胞无毒性和渗漏作用,但检测到自激活作用.
结论:成功构建了用于检测STAT4,STAT6与CBP相互作用的酵母双杂交系统,但检测到诱饵蛋白CBP有自激活作用.第二部分诱饵蛋白CBP自激活结构域的检测目的:将CBP蛋白的各主要结构域分别构建到诱饵表达载体pGBKT7上,分别检测其毒性,渗漏和自激活作用来明确CBP蛋白分子中起自激活作用的关键结构域.酵母双杂交检测STAT4,STAT6与CBP各主要结构域间的相互作用目的:酵母双杂交检测STAT4,STAT6与CBP各主要结构域(TAZ1结构域除外)间的相互作用.
方法:将酵母表达质粒pGADT7-STAT4/6分别与pGBKT7-CBP529-1200,pGBKT7-CBP967-1574和pGBKT7-CBP1678-2175共转化酵母AH109细胞,铺相应营养缺陷的培养板,通过报告基因表达检测筛选阳性克隆.
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