A673

A673可以用于KDSR调控鞘脂代谢与未折叠蛋白反应参与白血病发生发展的研究验证KDSR在白血病中的重要作用,探讨其参与白血病发生发展的可能机制.
[方法]1,应用CRISPR/Cas9文库筛选技术在MOLM13和MV4-11细胞中鉴定参与白血病细胞生存的重要鞘脂酶;
2,通过在8种不同癌症细胞中进行生存竞争实验验证鞘脂酶KDSR在白血病中的重要性;
3,通过流式细胞仪检测MOLM13和MV4-11中敲除KDSR基因后细胞凋亡及周期,细胞染色及电镜检测细胞的分化及内质网变化;
4,应用质谱分析检测KDSR敲除后主要鞘脂改变情况;
5,RNA-seq分析KDSR影响白血病细胞的可能信号通路,并通过蛋白印迹法(Western blot,WB)进行验证;
6,通过透射电子显微镜检测KDSR敲除后,增加鞘脂或内质网应激药物处理后细胞内质网的形态变化;
7,通过流式细胞仪检测检测在不同癌症细胞汇总增加相应鞘脂或内质网应激药物处理后对细胞生存率的改变情况;
8,通过流式细胞仪检测不同癌症细胞在敲除KDSR基因,增加鞘脂,以及内质网应激相关药物治疗后细胞的生存比率,分析其在白血病细胞与其他癌症细胞中的差异;
9,应用流式细胞仪检测不同癌症细胞中内质网应激药物与KDS双处理后白血病细胞与其他癌症细胞的生存差异.
[结果]1,在白血病细胞株MOLM13和MV4-11细胞中,通过对29个鞘脂酶基因进行CRISPR/Cas9文库筛选发现KDSR基因对白血病细胞生存最重要,生存竞争实验验证了敲除KDSR后白血病细胞MOLM13,MV4-11,Jurkat和Hut78细胞活性明显降低,而其他细胞293T,U251,SW620以及A673在KDSR敲除后细胞活性无明显变化;
2,在MOLM13和MV4-11细胞中将KDSR敲除后,Annexin V和活性Caspase3检测均表明细胞凋亡明显增加,Ed U检测显示S期细胞明显减少,有明显统计学意义,提示细胞阻滞在G1/S期;
3,细胞形态学及内质网形态检测发现内质网从长条状变成圆形,但分化不受影响;
4,MOLM13和MV4-11细胞敲除KDSR后3-脱氢鞘氨酸(3-ketodihydrosphingosin,KDS)明显增加,鞘脂从头合成途径的其他鞘脂比如二氢鞘氨醇(Dihydrospingosin,DHS),二氢神经酰胺(Dihydr℃eramide,DHCer)以及神经酰胺(Ceramide,Cer)均有不同程度的增加,但无明显统计学意义,相反,参与补救合成途径的部分鞘脂例如糖化神经酰胺(Glyc℃eramide,Gly Cer)和鞘磷脂(Sphingomyelin)则相对下降,没有统计学意义.
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