ATDC5小鼠胚胎瘤细胞

用于长链非编码RNA MALAT 1通过microRNA-19b抑制脂多糖诱导ATDC 5细胞损伤的作用机制研究
探讨长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录因子1(lncRNA MALAT 1)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠软骨祖细胞(ATDC5)炎症损伤的影响,并探讨其可能机制.
研究方法1,LPS诱导ATDC5细胞凋亡和炎性损伤.在DMEM/F12中培养ADTC5细胞,应用LPS进行处理.采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定不同浓度LPS处理后的ATDC5细胞活性.采用AnnexinV-PE染色法检测不同浓度LPS处理后的ATDC5细胞凋亡.应用Western blotting方法检测不同浓度LPS处理后凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax\Pro-caspase3,Cleaved-caspase3,Pro-caspase9和Cleaved-caspase9的表达.分别用定量逆转录PCR(qRT-PCR)和Western blotting方法检测LPS处理后ATDC5细胞中IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表达.应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测LPS处理后ATDC5细胞培养上清中IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-α的浓度.
2,LPS处理后ATDC 5细胞中MALAT1的表达.用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LPS处理后ATDC5细胞中MALAT1的表达.
3,MALAT1对LPS诱导的ATDC 5细胞炎性损伤的作用.用pEX-MALAT1和shMALAT1转染LPS处理后的ATDC5细胞.分别用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法和AnnexV-pe染色法检测LPS处理pEX-MALAT1和sh-MALAT1转染后ATDC5细胞活性和凋亡率.用qRT-PCR检测ATDC 5细胞中MALAT1的表达.设立对照组,LPS处理组,LPS+pEX组,LPS+pEX+MALAT1组和LPS+shNC组,LPS+sh+MALAT1组.Western blotting方法分别检测各组Bcl-2,Bax,Pro-caspase 3,.Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9,Pro-caspase 9的表达,用qRT-PCR和Western blotting检测各组ATDC5细胞中IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表达.ELISA法检测上清液中的IL-1β,IL-6,IL-8和TNF-α的浓度.
4,MALAT1对ATDC5细胞中miR-19b表达的调控.转染pEX-MALAT1或sh-MALAT1后,用qRT-PCR方法检测转染后ATDC5细胞中miR-19b的表达.5,MALAT1通过miR-19b调控LPS诱导ATDC5细胞的炎症损伤.用miR-19b抑制剂转染ATDC5细胞.采用qRT-PCR法检测转染miR-19b抑制剂后ATDC5细胞中miR-19b的表达.
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