alpha-淀粉酶

(1)载体pxmj19-aph213的制备.
载体pxmj19-aph213的构建过程...
以引物aph213F和aph213R从载体xk99e载体上扩增出aph213基因,所用的引物...
aph213F:ccggatatcagcttcacgctgccgcaagcac
aph213R:ccgaagcttaattctgtttcctgtgtgaaattg
PCR条件...95℃ 4min;95℃ 30s,62℃ 30s,72℃ 1min,35个循环;72℃ 7min.
上述引物的设计使得aph213基因扩增过程中,在aph213基因上游形成EcoRV切点,下游形成HindIII 切点,aph213的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;回收PCR产物并以EcoRV和HindIII酶切,通过T4DNA连接酶,连接到同样经过EcoRV和HindIII酶切的载体pxmj-19上,获得载体pxmj19-aph213.
载体pxmj19-aph213的扩增过程...
a,在50ml离心管中加入3ml的LB培养基,加入1.5ul的34mg/ml的氯霉素抗生素;
b,挑取带有载体pxmj19-aph213的大肠杆菌DH5α转接至上述培养基中,在37℃,230rpm的条件下培养12h,以扩增pxmj19-aph213质粒;
c,根据质粒提取试剂盒的说明书提取pxmj19-aph213质粒.
(2)枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因的扩增与改造.
以引物AmyF和AmyR从枯草芽孢杆菌的基因组上扩增出α-淀粉酶基因,所用的引物...
AmyR:ccgctcgagtcagtggtggtggtggtggtgatggggaagagaaccgcttaag;
AmyF:ccgaagcttgaaaggaggacctaatgtttgcaaaacgattcaaaacc;
PCR条件...95℃ 4min;95℃ 30s,62℃ 30s,72℃ 2min,35个循环;72℃7min.
上述引物的设计使得α-淀粉酶基因扩增过程中,在α-淀粉酶基因上游形成e3 SD序列,下游形成组氨酸标签,上游酶切位点为HindIII,下游酶切位点为XhoI;
(3)构建重组载体.
回收PCR产物并用XhoI和HindIII酶切,通过T4DNA连接酶,连接到同样经过XhoI和HindIII酶切的载体pxmj19-aph213上,获得重组表达载体pxmj19-aph213-amy.
(4)构建重组菌.
将重组表达载体pxmj19-aph213-amy转入大肠杆菌中进行预扩增,培养基为LB培养基,氯霉素浓度为50ug/ml;提取后,用电转化的方法转入谷氨酸棒杆菌中,在LBHIS恢复培养基中30℃培养,氯霉素浓度为30ug/ml.
(5)培养重组菌,分泌表达α-淀粉酶.
将长出的转化子转接到装有50ml培养基的250ml的三角瓶中进行培养,培养基为BHI培养基,培养条件为30℃,230rpm,48h.
(6)α-淀粉酶的纯化.
a,将重组菌的培养物进行离心,12000rpm,4℃,5min,获得含有α-淀粉酶的上清.
b,将含有α-淀粉酶的上清进行亲和层析,首先用缓冲液A平衡镍柱,将含有α-淀粉酶的上清过滤并上样至平衡后的镍柱,继续用缓冲液A平衡至基线水平后继续平衡3个柱体积;用100mmol的B液洗脱,收集洗脱的洗脱液,每管收集0.5ml;
缓冲液A为:300mM NaCl,20mM Tris,pH8.0的缓冲液,缓冲液B为:300mM NaCl,250mM 咪唑,20mM Tris,pH8.0的缓冲液.
c,对含有α-淀粉酶的洗脱液通过脱盐柱进行脱盐,获得纯化的α-淀粉酶溶液,-20℃保存;
脱盐用的缓冲液为50mM的PBS缓冲液,pH为7.0.
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