15α-羟基左旋乙基甾烯双酮

胡晓杰等人针对真菌培养过程中出现的退化问题,对雷斯青霉采用灭菌胡萝卜作为斜面培养基进行了复壮处理,并通过添加水溶性离子液体的方式提高底物的溶解与传递.操作...
1. 菌种与培养基
雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC 10490,购自美国典型菌种保藏中心.斜面培养基(g/L):葡萄糖 20,麦芽提取物 20,蛋白胨 3,琼脂 20,pH 自然,121℃灭菌20,min.发酵培养基 (g/L) :葡萄糖 30,玉米浆 10 ,NaNO 3 2,KH 2 PO 4 1,K 2 HPO 4 2,MgSO 4 0.5,FeSO 4 0.02,KCl 0.5,pH 7.5,121,℃灭菌 20,min.胡萝卜斜面培养基:将新鲜的胡萝卜纵切开,按试管大小将胡萝卜削成斜面形状,装入试管,115℃灭菌 15min.
2.标准曲线的制作
精密称取干燥至恒质量的 15, 13BETA-乙基-15ALPHA-羟基甾烷-4-烯-3,17-二酮标准品1.0mg 溶于甲醇中,配制成1.0mg/mL 的标准品溶液,并以此母液配制 0.050-0.350mg/mL 的系列标准溶液.
3.菌体的复壮方法
以胡萝卜斜面培养基培养雷斯青霉,按照菌苔厚,颜色等指标选择较优斜面,接入斜面培养基培养.
4.孢子悬浮液制备及甾体转化
孢子悬浮液的制备:用无菌水将菌种斜面制成孢子悬浮液,双层纱布过滤,除去菌丝.利用血球计数板,对单位体积内无菌水中所含有的雷斯青霉孢子数
进行计算.底物投料方式:采用干粉投料,即将底物左旋乙基甾烯双酮粉碎,粒度 14-16µm.在无菌条件下迅速投入已培养好的发酵液中,并加入亲水性离子液体[EMIm][EtOSO 3 ](1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯盐).在发酵液内,采用干粉投料方式加入底物,开始微生物转化.液体发酵培养:摇床转速 180r/min,转化温度为28℃,转化 72-96h 后,料液经过滤,滤液处理后,分析测定转化率.
5.转化产物的检测
用高效液相色谱法(HPLC)分析发酵液中产物13BETA-乙基-15ALPHA-羟基甾烷-4-烯-3,17-二酮的含量.分析条件:Agilent 1100 液相色谱系统,Agilent 色谱工作站,ODS-2HPERSIL 色谱柱,C18 柱 5µm,流动相为甲醇(色谱纯)和水,体积比为 80﹕20,流量为 1mL/min,紫外检测波长为 241nm,柱温为 20℃,进样量为10µL.
结果:经复壮处理后的雷斯青霉对 13BETA-乙基-15ALPHA-羟基甾烷-4-烯-3,17-二酮的产物转化率提高了 26.3%.同时采用水溶性离子液体 1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯盐([EMIm][EtOSO 3 ])作为促溶剂,运用到雷斯青霉羟基化甾体化合物左旋乙基甾烯双酮的体系中,并对其摇瓶发酵条件进行优化,在条件下,促溶剂添加量为 4%,底物左旋乙基甾烯双酮投料量为5g/L,投料时间为 30h,转化 72h 后,转化率最高可达 68.1%.
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