从盾叶薯蓣根状茎分离Dzf12菌株需经严格表面灭菌:70%乙醇处理30秒后,用0.2%氯化汞消毒20分钟,无菌操作切块接种于PDA培养基,25℃培养7-20天.采用三级发酵体系进行规模化生产:首先在500mL三角瓶装液量250mL的PDB培养基中预培养,再转移至1000L发酵罐进行15天深层发酵(25℃,150rpm),最终获得67L发酵液.
提取纯化采用多级层析技术:
1.菌液经正丁醇萃取后与菌丝丙酮提取物合并(总提取物206.3g)
2.正相硅胶柱(100-300目)进行氯仿-甲醇梯度洗脱(100:0→100:20)
3.活性组分经SephadexLH-20凝胶柱,RP-18反相柱精制
4.最终通过制备型HPLC分离获得纯度＞95%的化合物
该工艺可实现螺二萘化合物工厂化生产,单批次可获得dIepoxInη/ζ混合物120mg,8-hydroxypalmarumycInCP215mg.值得注意的是,化合物1(8-hydroxypalmarumycInCP2)是首次发现的C-8位羟基取代新结构,其分子式C20H14O5经HR-ESI-MS确认(实测值333.07689[M-1]).
五种分离化合物的结构通过核磁共振波谱完整解析:
-8-hydroxypalmarumycInCP2:黄色针晶(氯仿),含特征性δH12.37(OH)信号及δC202.4(C=O)羰基碳
-dIepoxInγ:具有2,3-环氧萘烷骨架,C-6位羟基与C-7位次甲基形成关键药效团
-dIepoxInχ:C-6位甲氧基化(δH3.30)显著提高水溶性
-dIepoxInη/ζ混合物(2:3):区别于其他衍生物的特征是C-6/C-7位分别存在饱和烃(η)和双键(ζ)