从菌种保藏(CCTCCNo:M2013081)到终产物提纯的完整流程包括:
种子培养阶段:采用含葡萄糖40g,蛋白胨4g的培养基,28℃振荡培养60小时;
发酵扩增阶段:100L规模发酵罐中,葡萄糖2200g与蛋白胨200g组成的培养基静置培养30天;
分离纯化环节:甲醇提取后经硅胶柱层析,采用梯度洗脱(1%-100%乙酸乙酯-石油醚),再通过SephadexLH-20凝胶柱精制,最终获得化合物1(27mg)和化合物2(55mg).此工艺已通过二倍半萜化合物工厂的中试验证,具备产业化转化条件.
通过EI-MS和NMR(CDCl3-d6,125MHz/400MHz)确定了两种化合物的分子量(358/374)及空间构型(如图1/2单晶结构所示).乙酰胆碱酯酶抑制实验显示:化合物1的IC50达2.3±0.1μM,化合物2为3.0±0.1μM,其活性显著优于传统植物来源抑制剂.这种高活性源于其特有的三环[]十二烷骨架及其羟基化修饰,能精准嵌入AChE活性口袋.