生产过程中的核心技术在于发酵培养基的配方设计:每升含NaCl10g,葡萄糖10g,细菌学蛋白胨5g,酵母膏5g,以及特定比例的镁,磷,钙盐.培养基经过115℃灭菌30分钟后,采用两阶段培养工艺:
1.种子培养阶段:28℃,120rpm摇床培养12-16小时
2.扩大发酵阶段:按5%接种量转移至发酵罐,相同条件下持续培养72小时
产物的分离纯化采用多级提取工艺:
1.初级萃取:发酵液经8000rpm离心后,以1:1体积比加入丁酮萃取3-4次
2.浓缩处理:合并萃取相后采用冷冻抽提干燥获得粗提物
3.柱层析分离:硅胶柱梯度洗脱(氯仿/甲醇体系从100:0至0:100)
4.精细纯化:AgIlentC18反相色谱柱进行HPLC制备,流动相为乙腈-甲酸体系
通过质谱和核磁共振分析(图4-9)确认产物结构,PCN的分子式C13H9N3O(m/z224.04)与标准品完全一致.该生物农药生产工厂采用的纯化工艺可使最终产品纯度达到98%以上,完全符合农用抗生素的制剂要求.