为了解决上述产率低的问题,本技术提供的方法是将甲戊二羟酸合成途径的关键酶乙酰辅酶A硫解酶,HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶超表达并定位至解脂耶氏酵母的过氧化物酶体.这一创新不仅提升了这些酶的活性,还减少了细胞内代谢产物的负面干扰,从而极大地提高了萜类化合物的合成效率.
具体来说,利用蛋白质羧基端的LGRGRRSKL九个氨基酸序列作为增强型过氧化物酶体定位信号ePTS1,通过遗传改造,将这三个关键酶定位到解脂耶氏酵母的过氧化物酶体中.随后,加入特定的萜类化合物合成酶,如α-法呢烯合成酶,β-胡萝卜素合成途径中的八氢番茄红素脱氢酶和番茄红素环化酶,或者芳樟醇合成酶,优化后的解脂耶氏酵母工程菌能够在含脂肪酸或油脂的培养基中,好氧条件下高效合成目标萜类化合物.
在实验中,分别构建了能够合成α-法呢烯,β-胡萝卜素和芳樟醇的工程菌株FP1,CP1和LP1.为了验证这些工程菌株的合成效率,实验选用改良YJX培养基,该培养基富含酵母粉,蛋白胨以及不同类型的脂肪酸或油脂,如油酸,三油酸甘油酯,大豆油,棕榈油等,还添加了吐温80以促进细胞内物质的转运.通过在30±1℃的温度下,以120~220rpm的转速摇瓶培养96~240小时,定期取样检测目标化合物的含量.结果显示,在使用油酸作为碳源时,工程菌株FP1,CP1和LP1的α-法呢烯,β-胡萝卜素和芳樟醇的产率显著高于对照菌株利用葡萄糖的产率,这证明了本方法的有效性.