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催化活性提高的γ-聚谷氨酸合成酶复合体及其基因工程技术

γ-聚谷氨酸的合成背景γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基形成的酰胺键缩合而成的聚阴离子类多肽分子.其分子量通常在100~1000kDa之间,具有水溶性,生物可降解性,良好的生物兼容性和低免疫原性,广泛应用于化妆品,生物医学和环境保护等领域.γ-聚谷氨酸的生产方法包括化学合成法,直接提取法和微生物发酵法.相较于化学合成法和直接提取法,微生物发酵法生产过程更易控制,发酵产量稳定,提取率高,便于大规模生产.近年来,通过基因工程技术筛选高产菌株,优化发酵条件以及构建高产基因工程菌成为研究热点.
📌 参考资料/链接：
Catalysis Reviews: Science & Engineering, 2025, 67(4): 1060-1125.

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γ-聚谷氨酸合成酶复合体的催化机制

γ-聚谷氨酸的合成需要四个关键酶的参与,分别是PgsB,PgsC,PgsA和PgsE.这些酶共同构成γ-聚谷氨酸合成酶复合体PgsBCAE,其编码基因pgsB,pgsA,pgsC,pgsE构成基因簇,属于同一个操纵子.

通过体外进化方法对来源于纳豆枯草芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸合成酶复合体PgsBCAE进行分子改造,结合高通量筛选技术,可以获得催化活性提高的突变体,从而实现γ-聚谷氨酸的高产量生物合成.


催化活性提高的γ-聚谷氨酸合成酶复合体的构建

通过基因工程技术,对PgsB,PgsC,PgsA和PgsE进行定向突变,获得催化活性提高的γ-聚谷氨酸合成酶复合体PgsBmCmAmEm.具体突变位点包括:

    PgsBm:第89位丝氨酸突变为天冬氨酸,第110位丝氨酸突变为半胱氨酸,第151位天冬氨酸突变为天冬酰胺,第188位赖氨酸突变为谷氨酸,第375位丙氨酸突变为丝氨酸.

    PgsCm:第23位赖氨酸突变为异亮氨酸,第104位谷氨酸突变为精氨酸.

    PgsAm:第24位赖氨酸突变为亮氨酸,第45位赖氨酸突变为谷氨酰胺,第90位谷氨酸突变为丙氨酸.

    PgsEm:第21位脯氨酸突变为丝氨酸.

将编码PgsBmCmAmEm的基因与载体pSTOP1622连接,构建重组载体pSTOP1622-pgsBmCmAmEm,并转化枯草芽孢杆菌BacIllussubtIlIsWB600,获得高产γ-聚谷氨酸的基因工程菌.



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