生物催化法合成骨化二醇的关键在于维生素D3的C25位羟基化反应.化学法难以实现这一特定位置的专一性羟基化,而生物法通过酶催化可以有效解决这一问题.细胞色素P450单加氧酶是常用的羟化酶,已有研究显示CYP105A1,CYP109A2,CYP109E1和Vdh等P450酶能够催化维生素D3转化为骨化二醇.然而,P450酶法存在辅酶NADPH成本高,底物浓度低,催化时间长等局限性,限制了其在工业化生产中的应用.
为了探索更高效的反应途径,研究人员将目光转向了过氧化物酶(UPO).UPO家族具有催化效率高,反应条件温和的优势,但其在异源表达中的低表达量和H2O2耐受性问题成为技术瓶颈.通过筛选和优化,研究人员从灰盖鬼伞(CoprInopsIscInerea)中分离出一种非特异性过氧化物酶CcIUPO,发现其对维生素D3的C25位羟基化具有较高的位置专一性.
为提升CcIUPO的催化活性,研究人员通过基因工程技术实现了其在毕赤酵母中的异源表达,并通过定点饱和突变技术获得了酶活力显著提高的突变体SEQIDNO:3.该突变体在5L发酵罐中诱导96小时后,酶活性超过1700U/L,能够高效催化维生素D3转化为骨化二醇,转化率在3h内达到80%以上.