大部分国内企业使用化学法生产CAMP,合成方法包括碱水解法,DCC脱水法,活性脂法,三氯氧磷法等.少数企业从大枣等天然产物中提取CAMP.但是,现有的化学合成法成本高,污染严重,原料毒性大.而从天然产物中提取的工艺复杂,获得的CAMP纯度低,一般仅作为保健品使用.这些不足限制了CAMP的大规模生产和广泛应用.基于这一现状,亟需开发高效,无污染且适合产业化的新型CAMP生产方法.
发酵法和酶法因为其环境友好的特点越来越受到重视.发酵法是通过筛选和培养产CAMP的菌株或者构建表达腺苷酸环化酶的重组菌株实现在细胞水平催化生产CAMP.但是,现有的发酵法所用菌株的发酵水平较低,还无法满足大规模工业生产的要求.酶法是通过使用腺苷酸环化酶催化ATP生成CAMP.与发酵法相比,酶法同样具有条件温和,无污染等特点.酶法的优点在于反应的产物更加专一,过程易于控制,反应体系中不含有微生物,有毒的原料试剂等杂质,非常有利于后续的分离纯化.目前,酶法生产CAMP的报道较少,原因在于酶的制备复杂.因此,有必要开发出高效的腺苷酸环化酶制备方法,简单的酶促反应体系,突破这一瓶颈.
为了克服现有技术的缺陷,可开发了一种酶法催化合成环磷酸腺苷的方法.该方法包括下列步骤:
1)获得表达腺苷酸环化酶的重组大肠杆菌;
2)获得表达钙调蛋白的重组大肠杆菌;
3)将所述步骤1)和步骤2)中获得的重组大肠杆菌诱导表达,并且破碎收集上清,加入三磷酸腺苷完成酶促反应,经有机溶剂处理后可获得高纯度的环磷酸腺苷.
在具体实施过程中,可首先根据百日咳腺苷酸环化酶毒素1-373位氨基酸的功能域的编码核苷酸序列来设计引物,在两侧引入酶切位点,PCR扩增后回收片段并连接到pET22b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选获得重组大肠杆菌.接下来,根据人钙调蛋白的编码核苷酸序列来设计引物,在两侧引入酶切位点,PCR扩增后回收片段并连接到pET22b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并筛选获得重组大肠杆菌.最后,可将重组大肠杆菌诱导表达,破碎菌体收集上清,加入三磷酸腺苷完成酶促反应,经有机溶剂处理后获得高纯度的环磷酸腺苷.