微生物法合成胆绿素是一种环境友好的替代方案,但现有技术在实际应用中仍面临诸多挑战.其中,内源性血红素生物合成速率的限制是影响胆绿素产量的主要因素.尽管国内外已有一些利用微生物合成胆绿素的研究报道,但其转化效率普遍较低,难以满足大规模生产的需求.为了解决这一问题,强化电子传递链系统成为提高胆绿素合成效率的关键.
电子传递链在细胞代谢过程中起着至关重要的作用,直接影响到辅酶NADPH的生成和血红素加氧酶HO的催化活性.通过优化电子传递链相关基因的表达,可以有效提高胆绿素的合成效率.研究表明,黄素氧还蛋白YqcA和铁氧还蛋白FPR在电子传递过程中扮演着重要角色,因此,强化这两种蛋白的表达成为提高胆绿素产量的重要策略.
为了突破胆绿素合成效率的瓶颈,本研究构建了一种重组大肠杆菌菌株,该菌株表达了来源于ClostrIdIumtetanI的血红素加氧酶HO,E.colI的谷氨酸脱氢酶GdhA,黄素氧还蛋白YqcA,铁氧还蛋白FPR以及膜锚蛋白Blc.其中,谷氨酸脱氢酶GdhA用于提供还原力,黄素氧还蛋白YqcA和铁氧还蛋白FPR用于强化电子传递链,而膜锚蛋白Blc则用于将血红素加氧酶HO锚定在细胞膜表面,从而增大HO与底物血红素的接触面积.
在构建过程中,以E.colIBL21(DE3)为表达宿主,使用pETDuet表达载体,依次连接编码上述蛋白的基因,并通过T7启动子实现相关基因的共表达.通过优化培养条件和诱导参数,最终成功构建了重组菌株BL21/pETDuet-EcgdhA/T7yqcA-blc/Ctho/T7fpr.该菌株在不依赖外源辅酶NADPH的条件下,显著缩短了胆绿素的转化时间,并将转化效率提升至86.5%,胆绿素产量达到77.6mg/L.