报道一,
生物催化法合成2'-脱氧鸟苷
1)产酶菌体的收集与预处理
产酶菌株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CGMCC1.1880在上述公知的产酶培养条件下进行繁殖生长并富产脱氧核苷核糖转移酶,得1升产酶发酵液,采用离心(离心条件:6000转/分钟,离心20分钟),收集得到57克菌体浆状物,然后用500毫升去离子水将菌体重新制成菌悬液并搅拌10分钟进行洗涤菌体,然后再上述相同的离心条件离心收集菌体,得到53克洗涤后的菌体浆状物.然后用1升0.5M磷酸缓冲液(pH8.0)洗涤,再经同样条件离心得到50克菌体浆状物.该菌体浆状物即为制备2'-脱氧鸟苷的生物催化剂.
2)生物催化合成2'-脱氧鸟苷
先在2升反应器将用800毫升去离子水使25克聚乙醇10000(PEG10000)溶解完全,然后一边搅拌一边加入30克磷酸二氢钾,溶解完全后,加入16.5克β-胸苷和10.3克鸟嘌呤,搅拌混合均匀.然后再加入步骤1)所得到50克菌体浆状物,同样搅拌使菌体分撒均匀.接着用去离子水定容至1升,最后用5M氢氧化钾溶液将转化体系的pH值调至8.0.pH值调节完毕后,置于水浴中,将反应温度升至40℃进行生物催化反应,反应过程中一直搅拌.反应36小时后,取样测定β-胸苷转化率和产物2'-脱氧鸟苷产率.测定方法采用高效液相色谱法(HPLC),其检测方法如下所示:
色谱柱:DiamonsilC18,5um,250x4.6mm;流动相:甲醇:0.02mol磷酸钾缓冲盐=20:80;流速:0.8ml/min;检测波长:254nm
HPLC分析结果显示,β-胸苷转化率为72%,产物2'-脱氧鸟苷产率为13.1g/L.
报道二,
在250ml三角瓶中装入50ml培养基,其中,含牛肉膏1%,蛋白胨1%,酵母膏0.5%,NaCl 0.5%,pH 7.0,于118℃灭菌30min,冷却后接入乙酰短杆菌QD96,于30℃振荡(200r/min)培养16h,将培养液经4000r/min冷冻离心30min,再用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤,再离心,所得之菌体冷藏保存,作为核苷酸磷酸化酶备用.
在100ml圆底烧瓶中,装入50ml底物溶液,其中含鸟苷酸和胸苷浓度各为40mol/L,磷酸缓冲液为25mmol/L,菌体加入量为5%(湿重),在恒温水浴中60℃搅拌反应2h,反应完毕,冷冻离心去除菌体和少量胸腺嘧啶沉淀物.然后将溶液经HPLC检测其中含24mmol/L脱氧鸟苷,其转化率达60%(见).经阴离子交换树脂分离,可获得0.26g 2'-脱氧鸟苷.
其中,阴离子交换树脂分离的方法,为公知的方法,在中国专利ZL98110601.3,ZL0213639.2等中已经有详细的报道.
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