1.植物甾醇转化为4-AD
1.1种子培养
菌种名称:mycobacterium sp.B-NRRL 3683
1.1.1斜面培养基
配方:蛋白胨0.1-1.0g/L,酵母膏0.1-1.0g/L,葡萄糖0.1-1.0g/L,磷酸氢二钠0.1-1.0g/L,琼脂20g/L,pH＝7.5-8.0.
121℃灭菌30分钟.凝固成型后,在无菌条件下接种.
接种后,30℃培养4天,入4℃冰箱保存,保存时间不超过1个月.
1.1.2摇瓶种子培养基
配方:蛋白胨0.1-1.0g/L,酵母膏0.1-1.0g/L,葡萄糖0.1-1.0g/L,磷酸氢二钠0.1-1.0g/L,pH＝7.5-8.0.121℃灭菌30分钟.冷却至室温.
1.1.2.1一级培养
在无菌条件下接种,接种量:每100毫升刮取1环.接种后,30℃,200rpm 摇床培养48小时.
1.1.2.2二级培养
在无菌条件下接种,接种量:10%.接种后,30℃,200rpm摇床培养48小时.
1.2 10升罐发酵转化
转化在10升罐中进行.计料体积:6升.接种后体积:6升.
1.2.1转化培养基
配方:玉米浆1-10%,硝酸钠0.1-1%,磷酸氢二铵0.01-0.1%,PPE0.1-2%,植物甾醇3%,大豆油16%,pH＝7.5-8.0.121℃灭菌30分钟,冷却至室温,于无菌条件下接种,接种量:20%.
1.2.2转化条件
28-32℃,200rpm,空气流量0.1-1.0vvm,罐压0.01-0.1MPa,转化时间88 小时,TLC点板监控转化情况,待转化完毕.
1.3脱氢前物料处理
将发酵完毕的发酵液加热至80℃,保温静置2小时,分层,下层水相作废水处理,得到上层油层.
2.4-AD转化为ADD
2.1种子培养
菌种名称:简单诺卡氏菌
2.1.1斜面培养
培养基配方:葡萄糖0.1-1%,玉米浆0.1-1%,蛋白胨0.1-0.5%,磷酸二氢钾0.01-0.15%,酵母浸膏0.01-0.05%和琼脂粉2%,PH＝7.0-7.2.培养条件:30±1℃,3-5天.
2.1.2一级种子培养
培养基配方:葡萄糖0.1-1%,玉米浆0.1-1%,蛋白胨0.1-0.5%,磷酸二氢钾0.01-0.15%和酵母浸膏0.01-0.05%,PH＝7.0-7.2.培养条件:500毫升摇瓶装100毫升培养基,摇床培养,转速200rpm,30 ±1℃,培养时间24小时.
2.1.3二级种子培养
培养基配方:葡萄糖0.1-1%,玉米浆0.1-1%,蛋白胨0.1-0.5%,磷酸二氢钾0.01-0.25%,4-AD 0.05%和泡敌0.02%,PH＝7.0-7.2.培养条件:500毫升摇瓶装100毫升培养基,摇床培养,转速200rpm,30±1℃,培养时间16-24小时.
2.1.4 10升罐种子转化培养
培养基配方:葡萄糖0.1-1%,玉米浆0.1-1%,蛋白胨0.1-0.5%,磷酸二氢钾0.01-0.25%,4-AD 0.05%和泡敌0.02%,PH＝7.0-7.2.121℃灭菌30分钟,冷却到30℃接种,接种量10%.加入步骤1.3中得到的油层,培养条件:28-32℃,200rpm,空气流量 0.1-1.0vvm,罐压0.01-0.1MPa,转化时间64小时,TLC点板监控转化情况,待转化完毕.
3.提取及精制
3.1提取
(1)将转化完毕的发酵液加热到80℃,静置2小时,分去水层,留油层;
(2)油层加入3升甲醇,常温搅拌20分钟,静置2小时,分出上层甲醇, 50℃减压浓缩干,加入少量水,带干其中残留的甲醇,冷却到30℃以下,抽滤出料;
(3)步骤(2)分离得到的油层再用甲醇提取两次,每次使用3升甲醇,将步骤(2)和步骤(3)分离出的甲醇合并,升温减压浓缩;
(4)浓缩得到的混合物过滤,得到的固体即ADD粗品.
3.2精制
(1)得到的ADD粗品,加入2%浓度的氢氧化钠溶液500毫升,升温至60℃,皂化2小时;
(2)冷却至10-20℃,抽滤并淋洗至中性,得类白色固体;
(3)得到的固体50℃烘干,称重,加入4V甲醇,升温至60℃,搅拌溶清,加入0.1W活性炭,搅拌脱色2小时,趁热抽滤并淋洗,滤液减压浓缩至2V体积,冷却至4℃,养晶1小时,抽滤;
(4)滤饼烘干,收ADD 55.2克,纯度99.5%.
产品链接: CAS No. 897-06-3››联系我们可以获取更多内容.
如有产品相关项目调研或推广服务, 请致函联系我们