将带有重组质粒pET-28a-ω-opt-TA的重组工程菌接种到20 mL含有50 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,180 rpm振荡过夜培养,然后以1%的接种量接种到含有50 µg/mL卡那霉素的100 mL LB液体培养基,37℃,180 rpm培养至OD600为0.6-0.8时,加入IPTG(终浓度为1 mmol/L),25℃,150 rpm继续诱导18 h.诱导结束后,4 ℃下4000×g离心10 min,收集菌体沉淀.用pH 8.0,0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤两次,除尽培养基后再用原发酵液体积1/10的破胞缓冲液重悬细胞,在冰浴中超声破胞90次(300 W,工作3 s,间隙6 s),12000×g离心10 min收集上清,即得到含有转氨酶活性的粗酶液.
采用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化.经上样,清洗和洗脱,收集洗脱液,透析除去小分子即得到纯酶.适当稀释后,以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度.Ni-NTA亲和层析过程中,细胞裂解缓冲液:50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠,300 mmol/L氯化钠,20 mmol/L咪唑,pH 8.0;洗脱缓冲液:50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠,300 mmol/L氯化钠,100 mmol/L咪唑,pH 8.0;再生缓冲液:50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠,300mmol/L氯化钠,250 mmol/L咪唑,pH 8.0.
Ni-NTA亲和层析后得到的ω-TA洗脱液经SDS-PAGE检测为电泳纯化,如所示,该酶液用20 mM pH8.0磷酸缓冲液4℃透析24小时,除去咪唑等小分子杂质,该重组酶于4℃冰箱保存.
以外消旋的三氟丙酮为底物,利用纯化的ω-TA酶为催化剂,于20-40℃,pH 6.5-8.5的缓冲体系中进行转化反应.例如,在2 mL的催化反应体系中,添加0.5 mg ω-TA,10 µmol三氟丙酮,30 µmol L-丙氨酸或L-天冬氨酸以及0-2 µmol PLP,在25 ℃反应0.5-3h,所得的产物用5mL 乙酸乙酯萃取,萃取液用于气相色谱分析底物的转化率.萃取液加入1 mL三乙胺后静置5 min,然后再加入1.2 mL乙酰氯反应10 min,所得的反应液用手性毛细管气相色谱法分析产物对映体过量值(ee).
采用气相色谱法分析底物的转化率.所用气相色谱仪为福立GC-9790气相色谱仪,气相色谱柱为30 m×250 µm×0.25 µm KF-3,进样口和检测器温度分别为 180 ℃和200 ℃,FID检测器,载气(氮气)流速30 mL/min,氢气流速为30 mL/min,空气流速为300 mL/min.程序升温条件为50 ℃维持5 min,10 ℃/min升温至180 ℃,维持5min.
用手性毛细管气相色谱法分析产物对映体过量值(ee).所用气相色谱仪为滕州经纬 GC8100,手性毛细管气相色谱柱为0.25 mm×25 m FS-LIPODEX-E,进样量为3 µL,进样口和检测器温度分别为180 ℃和200℃,载气(氮气)流速30 mL/min,氢气流速为30 mL/min,空气流速为300 mL/min.程序升温条件为100℃维持2 min,5℃/min升温至150℃,维持5min.
将带有重组质粒pET-28a-ω-opt-TA的重组工程菌接种到20 mL含有50 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,180 rpm振荡过夜培养,然后以1%的接种量接种到含有50 µg/mL卡那霉素的100 mL LB液体培养基,37℃,180 rpm培养至OD600为0.6-0.8时,加入IPTG(终浓度为1 mmol/L),25℃,150 rpm继续诱导18 h.诱导结束后,4 ℃下4000×g离心10 min,收集菌体沉淀.用pH 8.0,0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤两次,除尽培养基后再用原发酵液体积1/10的破胞缓冲液重悬细胞,在冰浴中超声破胞90次(300 W,工作3 s,间隙6 s),12000×g离心10 min收集上清,即得到含有转氨酶活性的粗酶液.
采用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化.经上样,清洗和洗脱,收集洗脱液,透析除去小分子即得到纯酶.适当稀释后,以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度.Ni-NTA亲和层析过程中,细胞裂解缓冲液:50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠,300 mmol/L氯化钠,20 mmol/L咪唑,pH 8.0;洗脱缓冲液:50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠,300 mmol/L氯化钠,100 mmol/L咪唑,pH 8.0;再生缓冲液:50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠,300mmol/L氯化钠,250 mmol/L咪唑,pH 8.0.
Ni-NTA亲和层析后得到的ω-TA洗脱液经SDS-PAGE检测为电泳纯化,如所示,该酶液用20 mM pH8.0磷酸缓冲液4℃透析24小时,除去咪唑等小分子杂质,该重组酶于4℃冰箱保存.
以外消旋的三氟丙酮为底物,利用纯化的ω-TA酶为催化剂,于20-40℃,pH 6.5-8.5的缓冲体系中进行转化反应.例如,在2 mL的催化反应体系中,添加0.5 mg ω-TA,10 µmol三氟丙酮,30 µmol L-丙氨酸或L-天冬氨酸以及0-2 µmol PLP,在25 ℃反应0.5-3h,所得的产物用5mL 乙酸乙酯萃取,萃取液用于气相色谱分析底物的转化率.萃取液加入1 mL三乙胺后静置5 min,然后再加入1.2 mL乙酰氯反应10 min,所得的反应液用手性毛细管气相色谱法分析产物对映体过量值(ee).
采用气相色谱法分析底物的转化率.所用气相色谱仪为福立GC-9790气相色谱仪,气相色谱柱为30 m×250 µm×0.25 µm KF-3,进样口和检测器温度分别为 180 ℃和200 ℃,FID检测器,载气(氮气)流速30 mL/min,氢气流速为30 mL/min,空气流速为300 mL/min.程序升温条件为50 ℃维持5 min,10 ℃/min升温至180 ℃,维持5min.
用手性毛细管气相色谱法分析产物对映体过量值(ee).所用气相色谱仪为滕州经纬 GC8100,手性毛细管气相色谱柱为0.25 mm×25 m FS-LIPODEX-E,进样量为3 µL,进样口和检测器温度分别为180 ℃和200℃,载气(氮气)流速30 mL/min,氢气流速为30 mL/min,空气流速为300 mL/min.程序升温条件为100℃维持2 min,5℃/min升温至150℃,维持5min.
在2 mL的20 mM pH 8.0磷酸缓冲液中,添加0.25 mg ω-TA,5 µmol三氟丙酮,15 µmol L-天冬氨酸以及0.1 µmol PLP,在25 ℃反应1h,得到转化率为97.0%的3,3,3-三氟丙胺.
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